Immunfixationselektrophorese

Mittels Elektrophorese lassen sich die Proteinbestandteile des Blutserums entsprechend ihrer physikalischen Eigenschaften (Größe und elektrische Ladung) in fünf oder sechs Fraktionen auftrennen, abhängig davon, ob eine Gelelektrophorese oder eine Kapillarzonenelektrophorese durchgeführt wird (bei letzterer gibt es zwei beta-Fraktionen).

Antikörper finden sich überwiegend in der Fraktion der Gammaglobuline. Sie können aber auch in anderen Fraktionen laufen, hauptsächlich in der angrenzenden beta- bzw. beta2-Fraktion. Obwohl hohe, schmalbandige Peaks in der Serumeiweißelektrophorese häufig auf Paraproteine hinweisen, ist anhand des Laufverhaltens allein kein sicherer qualitativer Rückschluss möglich.

Mittels Immunfixationselektrophorese können die enthaltenen Gammaglobuline dahingehend untersucht werden, welche Subtypen in welcher Verteilung vorliegen. Typische Bandenmuster lassen eine eindeutige Identifikation der Immunglobuline zu. Scharfe Banden weisen darauf hin, dass es Immunglobuline monoklonalen Ursprungs sind, die alle dasselbe Migrationsverhalten haben (siehe Bildbeispiel unten). In der Regel werden IgG, IgA und IgM sowie Kappa- und Lambda-Leichtketten untersucht. In bestimmten Fällen kann die Immunfixationselektrophorese auch auf IgD und IgE erweitert werden, z.B. wenn eine deutliche Bande bei einer Leichtkette ohne dazu passende Bande bei IgG, IgA oder IgM gefunden wird.

Der Nachweis einer Paraproteinämie ist meist Ausdruck einer zugrundeliegenden Erkrankung mit monoklonaler Gammopathie (z.B. Multiples Myelom oder Morbus Waldenström).

• Identifizierung monoklonaler Immunglobuline z.B. bei Multiplem Myelom oder Amyloidose

• Serum und/oder Urin

Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proteine im Agarosegel wird als zweiter Träger eine Celluloseacetatfolie aufgebracht. Sie ist streifenförmig mit monospezifischen Immunseren, d.h. mit Antikörpern gegen IgG, IgA usw., getränkt. Es kommt zur Ausbildung spezifischer Antigen-Antikörper-Komplexe, die zu groß und unlöslich sind, um bei der anschließenden Reinigung aus dem Gel ausgewaschen zu werden ("Immunfixation"). Andere, ungebundene Proteine können schnell und vollständig entfernt werden.

Durch Anfärben mit geeigneten Farbstoffen können die fixierten Immunkomplexe sichtbar gemacht werden. Deutliche, scharf abgegrenzte Banden, die nur ein Immunglobulin und eine Leichtkette in der korrespondierenden Position betreffen, sprechen für ein monoklonales, pathologisches Paraprotein.

Beispiel einer Immunfixation bei ausgeprägtem M-Gradienten Typ IgG Lambda. Ausführliche Erläuterung bei der Bilddatei.

Neben Blutserum kann auch der Urin auf das Vorliegen von Antikörpern untersucht werden. Bei einer Paraproteinämie kann die Resorptionskapazität der Nieren überschritten werden, sodass es zur Proteinurie kommt.

Werden ausschließlich freie Leichtketten nachgewiesen, liegt eine isolierte Bence-Jones-Proteinurie vor, werden außerdem noch Antikörper bzw. gebundene Leichtketten nachgewiesen, handelt es sich um eine Paraproteinämie mit Bence-Jones-Proteinurie.

Im zweiten Fall müsste das Blutserum dahingehend untersucht werden, welche Paraproteinämie vorliegt.

Die Nachweisgrenze für Immunglobuline liegt bei etwa 20 mg Immunglobulin/l.

Therapeutische monoklonale Antikörper werden in der Immunfixationselektrophorese genauso nachgewiesen wie pathologische, allerdings erzeugen sie meist nur schwache Banden. Dies ist bei der Auswertung zu berücksichtigen. So erscheint z.B. Daratumumab, das häufig bei der Behandlung des Plasmozytoms eingesetzt wird, als zusätzliche Bande vom Typ IgG-Kappa in der Immunfixationationselektrophorese, wenn diese im Rahmen der Verlaufskontrolle des Plasmozytoms durchgeführt wird.

    
        
    
Beispiel für den Nachweis des therapeutischen monoklonalen Antikörpers Daratumumab in der Immunfixation. Weitere Details siehe bei der Bilddatei.

Blotting auf Nitrocellulosemembran

Da die Antikörper im Agarosegel in einer relativ dicken Schicht lokalisiert sind, kann das Anfärben und damit die Sensitivität des Nachweises nachteilig beeinflusst werden. Durch Übertragen der Antikörper nach der Elektrophorese auf eine dünnere Nitrocellulosemembran kann die Sensitivität erhöht werden.

Subtraktionskapillarelektrophorese

Bei sehr kleinem Probenvolumen oder um einen höheren Probendurchsatz zu erzielen, kann die Kapillarelektrophorese genutzt werden. Diese lässt sich zudem leichter automatisieren.

Dabei wird zuerst untersucht, ob das unbehandelte Patientenserum einen M-Gradienten zeigt. Ist dies der Fall, werden Aliquots des Nativserums mit spezifischen Antikörpern gegen IgG, IgM, Kappa-Leichtketten, Lambda-Leichtketten usw. versetzt, analog zur Gelelektrophorese. Dies führt zu einer Bildung von Immunkomplexen mit den Patienten-Immunglobulinen, die daraufhin an der ursprünglichen Wanderungsposition nicht mehr nachweisbar sind, sozusagen subtrahiert wurden. Anhand des zugesetzten Antikörpers kann dann nachgewiesen werden, welches Patienten-Immunglobulin den M-Gradienten gebildet hat.

• Hallbach, Klinische Chemie und Hämatologie, Thieme Verlag, 3. Auflage, 2019
• Engels und Lottspeich, Bioanalytik, Springer Spektrum, 3. Auflage, 2012