Knock-in
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LoslegenSynonyme: Gen-Knock-in, Knockin
Englisch: knock-in, gene knock-in
Definition
Als Knock-in bezeichnet man ein Verfahren der Gentechnik, bei dem eine definierte DNA-Sequenz gezielt an einem vorbestimmten Ort des Genoms eingefügt wird.
Das Gegenstück ist der Knock-out, bei dem ein Gen gezielt ausgeschaltet wird.
Hintergrund
Beim Knock-in wird der Zielort vorgegeben. Darin unterscheidet er sich von der klassischen Transgenese, bei der die fremde DNA an zufälliger Stelle ins Genom integriert. Die zufällige Integration birgt das Risiko, dass körpereigene Gene zerstört werden oder dass die Expression je nach Integrationsort stark schwankt. Der Knock-in umgeht dieses Problem.
Ein Knock-in kann sehr unterschiedliche Veränderungen umfassen:
| Variante | Beschreibung | Typische Anwendung |
|---|---|---|
| Punktmutation | Austausch einzelner Nukleotide im endogenen Gen | Nachbildung krankheitsrelevanter Mutationen |
| Reportergen-Knock-in | Einfügen eines Reportergens unter die Kontrolle eines endogenen Promotors | Darstellung der Genexpression im Gewebe |
| Protein-Tag | Anfügen einer Markierungssequenz an ein endogenes Gen | Lokalisation und Nachweis des Proteins in physiologischer Menge[1] |
| Humanisierung | Ersatz eines Gens durch seine menschliche Entsprechung | Präklinische Testung humanspezifischer Wirkstoffe |
| Gezielte Integration | Einbau einer vollständigen Expressionskassette an einem definierten Lokus | Zell- und Gentherapie |
Methoden
Homologe Rekombination
Das klassische Verfahren beruht auf der homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen der Maus. Ein Zielvektor enthält die gewünschte Sequenz, flankiert von zwei langen Homologiearmen, die den Bereichen beiderseits des Zielorts entsprechen. Zellen mit korrektem Einbau werden über Selektionsmarker angereichert, in Blastozysten injiziert und auf Ammentiere übertragen. Aus den entstehenden chimären Tieren wird eine Linie mit der Veränderung in der Keimbahn gezüchtet. Das Verfahren ist zuverlässig, aber langwierig und auf wenige Spezies beschränkt.
Nukleasen und CRISPR
Programmierbare Nukleasen, insbesondere CRISPR/Cas9, erzeugen am Zielort einen DNA-Doppelstrangbruch. Dieser erhöht die Rate des gezielten Einbaus erheblich und macht den Knock-in auch in Zelltypen und Spezies möglich, in denen die homologe Rekombination allein zu ineffizient ist. Für die Reparatur stehen zwei Wege zur Verfügung:
- Homologiegerichtete Reparatur (HDR): nutzt eine mitgelieferte Reparaturvorlage mit Homologiearmen und arbeitet präzise. Sie ist jedoch auf die S- und G2-Phase des Zellzyklus beschränkt und daher in ruhenden Zellen wenig effizient.[2]
- Homologieunabhängige gezielte Insertion (HITI): nutzt die nicht-homologe Endverknüpfung und funktioniert auch in nicht teilungsaktiven Zellen. Die Orientierung des Einbaus lässt sich dabei weniger streng kontrollieren.
Zahlreiche Strategien zielen darauf, die Ausbeute zu steigern, etwa durch Zellzyklus-Synchronisation, Hemmung der konkurrierenden Endverknüpfung oder optimierte Reparaturvorlagen.
Editierverfahren ohne Doppelstrangbruch
Für kleine, genau definierte Änderungen stehen Verfahren zur Verfügung, die ohne Doppelstrangbruch auskommen. Beim Base Editing wird eine einzelne Base chemisch umgewandelt.[3] Beim Prime Editing wird die gewünschte Sequenz über eine verlängerte Leit-RNA direkt in das Genom geschrieben. Damit sind Punktmutationen sowie kleine Einfügungen und Deletionen ohne Reparaturvorlage möglich.[4]
Konditionale Knock-ins
Über Rekombinasesysteme wie Cre-loxP lässt sich die eingefügte Veränderung zeitlich und gewebespezifisch steuern. Die Sequenz wird zunächst durch eine von loxP-Stellen flankierte Stoppkassette inaktiv gehalten und erst nach Expression der Rekombinase aktiviert. Dieses Vorgehen ist erforderlich, wenn eine konstitutive Veränderung während der Embryonalentwicklung letal wäre.
Anwendungen
Krankheitsmodelle
Knock-in-Tiere tragen die krankheitsrelevante Mutation im endogenen Lokus und unter physiologischer Regulation. Sie bilden Erkrankungen daher oft naturgetreuer ab als transgene Modelle mit Überexpression. Eingesetzt werden sie unter anderem bei der Alzheimer-Krankheit, der Chorea Huntington, bei Kardiomyopathien und bei autoinflammatorischen Erkrankungen.[5]
Humanisierte Modelle
Beim humanisierten Knock-in wird das Mausgen durch die menschliche Entsprechung ersetzt. Solche Modelle sind erforderlich, wenn ein Antikörper oder Wirkstoff nur das menschliche Zielmolekül erkennt. Beschrieben sind unter anderem humanisierte Modelle für CD3ε und den Gerinnungsfaktor XII.[6]
Zell- und Gentherapie
In der CAR-T-Zelltherapie wird der chimäre Antigenrezeptor zunehmend gezielt in einen definierten Lokus eingefügt, statt ihn über virale Vektoren zufällig zu integrieren. Wird er in den TRAC-Lokus eingebracht, steht er unter der Kontrolle des endogenen Promotors und schaltet zugleich den körpereigenen T-Zell-Rezeptor aus.[7] Darüber hinaus wird der gezielte Einbau korrigierender Gensequenzen als Therapieansatz bei monogenen Erkrankungen erprobt.[8]
Limitationen
Der gezielte Einbau ist technisch deutlich anspruchsvoller als ein Knock-out, da er auf präzise Reparaturwege angewiesen ist. Folgende Punkte sind zu beachten:
- niedrige Ausbeute, besonders in nicht teilungsaktiven Zellen
- ungewollte Einfügungen und Deletionen am Zielort durch fehlerhafte Reparatur
- Off-Target-Effekte an ähnlichen Sequenzen des Genoms
- mögliche zufällige Integration der Reparaturvorlage an anderer Stelle
- aufwendige Validierung des korrekten Einbaus auf beiden Allelen
Quellen
- ↑ Bukhari H, Müller T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends Cell Biol. 2019;29(11):912–928.
- ↑ Liu M et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Front Genet. 2018;9:691.
- ↑ Porto EM et al. Base editing: advances and therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(12):839–859.
- ↑ Chen PJ, Liu DR. Prime editing for precise and highly versatile genome manipulation. Nat Rev Genet. 2023;24(3):161–177.
- ↑ Zhong MZ et al. Updates on mouse models of Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 2024;19(1):23.
- ↑ Beck S et al. Generation of a humanized FXII knock-in mouse – A powerful model system to test novel anti-thrombotic therapeutics. J Thromb Haemost. 2021;19(11):2835–2840.
- ↑ Balke-Want H et al. Homology-independent targeted insertion (HITI) enables guided CAR knock-in and efficient clinical scale CAR-T cell manufacturing. Mol Cancer. 2023;22(1):100.
- ↑ Liu D et al. Recent advances in therapeutic gene-editing technologies. Mol Ther. 2025;33(6):2619–2644.