DNA-Synthese

Die DNA-Synthese ist eine semikonservative Replikation, bei der ein "alter" Strang als Matrize für einen neuen dient. Sie gliedert sich in Initiation, Elongation und Termination. Das Prinzip ist in Prokaryonten und Eukaryonten ähnlich, aber es gibt gewisse Unterschiede im Ablauf und in der beteiligten Proteinmaschinerie. Ein besonderer Unterschied ist auch, dass der Replikationszyklus in Eukaryonten wesentlich strenger reglementiert ist als in Prokaryonten - dies liegt vor allem an der Größe und Komplexitität der eukaryotischen Genome.

Die Initiation läuft bei beiden Lebensformen sehr verschieden ab und ist bei Bakterien deutlich besser erforscht, weswegen sie hier getrennt zwischen Prokaryonten und Eukaryonten betrachtet wird.

Prokaryonten verfügen nur über einen Replikationsursprung, den sogenannten ori (in E.coli speziell oriC). Er weist spezielle Sequenzen auf, die DnaA-Boxen, die von den DnaA-Proteinen erkannt werden. Lagern sich letztere an den doppelsträngigen DNA-Strang an, wickelt sich dieser um die Moleküle herum. Ab einer gewissen Zahl von 20 Molekülen wird die DNA innerhalb von 60 Basenpaaren aufgeschmolzen. Erleichtert wird dies durch die A-T-reichen Sequenzen in diesem Bereich, die besonders leicht aufzuspalten sind. An den nun offen liegenden DNA-Bereich kann der Helikase-Loader DnaC die Helikase DnaB anbringen. Anschließende rekrutiert die Helikase die Primer-Polymerase, im Falle von Prokaryonten das DnaG-Protein.

In Eukaryoten befinden sich Replikationsursprünge an verschiedenen Stellen der DNA. Hier bindet der ORC (Origin Recognition Complex) spezifisch an die aufgeschmolzene DNA und bildet zusammen mit der replikativen Helikase MCM, sowie deren Beladungsproteinen cdc6 und cdt1, den präreplikativen Komplex. Die Helikase besteht aus sechs unterschiedlichen Untereinheiten (MCM2-7), die ein ringförmiges Hexamer bilden. Nach der Beladung auf die DNA rekrutiert die Helikase die Polymerase α und die Primase zur Primererstellung. Nach dessen Bindung beginnt sie unter ATP-Verbrauch, die DNA in eine Richtung zu entwinden. Da sich die einzelsträngige DNA sehr leicht verknotet oder Sekundärstrukturen bildet, werden durch Einzelstrang-bindende Proteine (RPAs) die beiden Einzelstränge stabilisiert. Es entsteht eine Replikationsgabel.

Die Elongation ist für Eukaryonten und Prokaryonten relativ ähnlich.

An den in der Initiation erstellten RNA-Primern kann die DNA-Polymerase ihre Synthese starten. Die DNA-Polymerase kann nur vom 5'-Ende zum 3'-Ende der DNA synthetisieren. Dadurch entsteht ein Strang als Leitstrang (leading strand), der kontinuierlich von 5' nach 3' synthetisiert wird und ein Folgestrang (lagging strand). Letzterer wird durch allmähliches Entwinden frei und durch die Anlagerung vieler Primer diskontinuierlich synthetisiert.

Diese einzeln und diskontinuierlich synthetisierten Stücke nennt man Okazaki-Fragmente. Sie sind durch die dazwischenliegenden RNA-Primer-Segmente unterbrochen, die dann von RNasen (DNA-Polymerase I und RNAase H in Prokaryonten) abgebaut und durch spezielle DNA-Polymerasen (bzw. Polymerase I in Prokaryonten) wieder aufgefüllt werden.

Die DNA-Ligase ist dafür verantwortlich, die Lücken zwischen den Okazaki-Fragmenten zu schließen, die durch die RNA-Primer entstanden sind und von der Polymerase nicht aufgefüllt werden können. Sie katalyisiert eine Adenylierung des 5'-Phosphat-Endes in der Lücke und ermöglicht so eine Bindung zwischen dem 5' und 3' Ende der beiden Kettenenden.

Die eigentliche Synthese der DNA besteht aus dem vielfachen Anfügen passender Desoxyribonukleotid-Moleküle an den Strang, katalysiert durch die Zinkfingerstruktur der DNA-Polymerase. Hierbei werden durch eine negativ polarisierte Aminosäure am katalytisch aktiven Zentrum zwei divalente Kationen (z.B. Mg²⁺) gebunden. Eines dieser Kationen sorgt für eine Aktivierung des 3' OH-Endes und das andere hält das Pyrophosphat fest, das als Energielieferant für die Synthese dient. Unter Hydrolyse dieses Moleküls kommt es dann zur Verknüpfung des Nukleotids mit der DNA-Kette.

Sowohl Eukaryonten als auch Prokaryonten weisen eine sehr geringe Fehlerrate bei der Replizierung ihres Erbgutes auf. Nur durchschnittlich alle 10⁷ Basen wird eine falsche Base dauerhaft in das Erbgut eingebaut, das liegt jedoch nicht allein an der jeweiligen Replikase, sondern am so genannten Proofreading. Die DNA-Synthese ist im Vergleich zur RNA-Synthese langsam, die Zellen lassen sich hierbei mehr Zeit, die Genauigkeit einer Synthese hängt vor der Geschwindigkeit ab. RNAs werden schnell abgelesen, da eine individuelle RNA meist nur temporär in der Zelle besteht, DNA jedoch muss stabil sein, sie gibt es nur einmal pro Zelle. Deswegen muss sie auch höchst exakt repliziert werden.

Die Zinkfingerstruktur ermöglicht neben dem bloßen Anfügen der Nukleotide auch eine andere Art des Proofreadings. Bevor eine Base fest an den Strang angefügt wird, umschließt die Polymerase mit ihren "Fingern" das Nukleotid. Ist es komplementär zur gegenüberliegenden Base, geht der Vorgang schnell vonstatten und der Einbau erfolgt. Ist das Nukleotid nicht komplementär, wird das Umschließen verzögert, so dass das Nukleotid weg diffundieren kann.

Eine weitere Möglichkeit des Proofreadings ist die 3'-5' Exonuclease-Aktivität der Polymerase. Wenn trotz der vorherigen Überprüfung mit den Zinkfingern eine falsche Base eingebaut wurde, erkennt die Polymerase dies anhand der ungünstig gestellten OH-Gruppe des 3'-Endes. Diese schneidet jetzt solange Basen ab, bis wieder eine richtig gelegene OH-Gruppe zur Verfügung steht. Erst dann startet sie die Polymeraseaktivität wieder.

Die DNA-Synthese endet, wenn zwei Replikationsgabeln ineinander übergehen. Bei den zirkulären Genomen der Prokaryonten entsteht am Replikationsende eine Verkettung des alten und neuen Genoms, in Form eines Catenans. Die Genome werden durch die Topoisomerase II wieder entkettet und können so leicht auf die Tochterzellen aufgeteilt werden.

Bei Eukaryonten werden nach der S-Phase die weiteren Schritte der Mitose oder Meiose eingeleitet.