DNA-Ligase

Synonym: Poly(deoxyribonukleotid)-3'-hydroxyl:5'-phospho-poly(deoxyribonucleotide) Ligase Englisch: DNA ligase

1 Definition

DNA-Ligasen sind Enzyme, welche die Verknüpfung des DNA-Rückgrats katalysieren. Sie haben daher eine wichtige Bedeutung in der Replikation und DNA-Reparatur.

2 Hintergrund

Wird in der DNA eine einzelsträngige Lücke durch Polymerasen aufgefüllt, so geschieht dies immer durch einen nukleophilen Angriff des vorhergehenden Nukleotids auf das neu-einzusetzende Nukleotid. Es kommt zur Ausbildung einer Phosphodiesterbindung zwischen dem 3'-OH und dem α-Phosphat des Nukleosidtriphosphats. Dies bedeutet aber auch, dass das letzte polymerisierte Nukleotid keine kovalente Bindung mit dem darauffolgenden, bereits eingesetzten Nukleotid ausbilden kann. Das DNA-Rückgrat ist an dieser Stelle unterbrochen. Diese Lücke wird durch die DNA-Ligasen verknüpft.

3 Vorkommen

• Eukaryoten:
  • DNA-Ligase I (LIG1)
  • DNA-Ligase III (LIG3)
  • DNA-Ligase IV (LIG4)
• Prokaryoten
  • DNA-Ligase (lig)
• Viren
  • T4-DNA-Ligase
  • T7-DNA-Ligase

Durch fehlerhafte Extraktionsmethoden wurde irrtümlich auch eine DNA-Ligase II identifiziert. Später Analysen ergaben jedoch, dass diese nur ein proteolytisches Fragment der DNA-Polymerase III ist und vom selben Gen (LIG3) abgelesen wird. Eine eigenständige Funktion dieses Fragments wurde bis heute (2018) nicht eindeutig nachgewiesen.

4 Biochemie

In Eukaryoten sind alle DNA-Ligasen ATP-abhängig. Prokaryotische und virale DNA-Ligasen können auch NAD⁺ abhängig sein. Der katalysierte Mechanismus ist aber bei allen Ligasen identisch. Prinzipiell muss der freie 5'-Terminus so modifiziert werden, dass er nukleophil angegriffen werden. Dies geschieht durch eine temporäre Übertragung eines Adenosinmonophosphats, das durch den Angriff wieder abgespalten wird. Der Reaktionsmechanismus besteht aus folgenden drei Schritten:

1. Adenosinmonophosphat wird von ATP oder NAD⁺ auf das aktive Zentrum der Ligase Übertragen.
2. Es wird nun kovalent an den freien 5'-Phosphat-Terminus übertragen.
3. Das 5'-Ende ist nun aktiviert und kann durch das 3'-OH Ende angegriffen werden. Dadurch kommt es zur Ausbildung der Phosphodiesterbindung und der Abspaltung des Adenosinmonophosphats.

Da der AMP-Ligase-Komplex sehr stabil ist, gilt es als Wahrscheinlich, dass dieser Schritt bereits weit vor den anderen Reaktionen stattfindet und die meisten Ligasen adenyliert vorliegen. Es kann auch zu einer fehlerhaften Ligation kommen. Hier liegt der 5'-Terminus bereits adenyliert vor, obwohl das 3'-OH noch nicht verfügbar ist. In diesem Fall entfernt in Eukaryoten das Protein Aprataxin das AMP.^[1][2]

5 Funktion

5.1 DNA-Ligase I

Die DNA-Ligase I verknüpft während der Replikation die Okazaki-Fragmente.

5.2 DNA-Ligase III

Die DNA-Ligase III wird in der Einzelstrangbruch- und Basenexzisionsreparatur rekrutiert. Sie wurde bisher aber nur in Vertebraten nachgewiesen. Von ihr existierten vier Splicevarianten, die jeweils unterschiedlich lokalisiert sind.

5.3 DNA-Ligase IV

Die DNA-Ligase IV verknüpft die Stränge in der Nicht-homologen Endverknüpfung. Diese Funktion übt sie auch analog in der V(D)J-Rekombination aus

5.4 DNA-Ligase (E. coli)

Die DNA-Ligase ist die einzige Ligase in E. coli und übernimmt sowohl die Funktionen in der Replikation, als auch der DNA-Reparatur.

6 Anwendung in der Biotechnologie

Besonders die viralen DNA-Ligasen (beispielsweise T4-DNA-Ligase) werden standardmäßig in molekularbiologischen Laboren in der Klonierung verwendet. Sie sind oft spezifisch für bestimmte DNA-Enden (blunt ends oder sticky ends), was die genaue Kontrolle des Ligierungsprozesses erlaubt.

7 Quellen

1. ↑ Ellenberger, T. & Tomkinson, A. E. Eukaryotic DNA ligases: structural and functional insights. Annu Rev Biochem 77,313-338,doi:10.1146/annurev.biochem.77.061306.123941 (2008).
2. ↑ Klug, W. S. Concepts of genetics. 10th edn. Pearson Education, 2012