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Klonierung

Englisch: molecular cloning

1 Definition

Als Klonierung bezeichnet man die systematische Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente. Hierbei ist die gewünschte Vermehrung von Erbsubstanz-Fragmenten in vivo bzw. in vitro möglich.

2 Klonierungsmechanismus

Für die Umsetzung der Klonierung ist ein Vektor unerlässlich. Dieser erfüllt die Funktion der Übertragung des DNA-Fragmentes (Transgen) in die auserwählte Empfängerzelle. Anhand der Klonierung kann man den gewünschten Phänotyp einer DNA-Sequenz analysieren bzw. mehrfach duplizieren.

Für den DNA-Transfer sind verschiedene Vektoren verwendbar.

2.1 Plasmid

Ein Plasmid besteht aus einem doppelsträngigen DNA-Ring. Von allen Vektoren besitzt es die geringste Aufnahmekapazität von DNA-Fragmenten (2kB). Er besitzt zum einen den origin of replication (ORI) für den Start der Amplifikation, zum anderen ein Resistenzgen, was den Vektor bei Anzucht auf einem Nährboden mit Breitbandantibiotikum wie z.B. Ampicillin vor dem Absterben bewahrt.

2.2 Lambda-Phage

Die Lambda-Phage gehört zur Klasse der Virusvektoren und weist mit 10 kB ein höheres Aufnahmevermögen auf.

2.3 Cosmid

Das Cosmid ist ebenfalls ein Virusvektor und besitzt am Ende des linearen Phagen-Chromosoms kohäsive Stellen (cos-sites). Die Kapazität beträgt 40kB.

2.4 Adeno-/Retroviren

Adenoviren bzw. Retroviren besitzen ein Genom in RNA-Form und müssen vor der Einschleusung in die Empfängerzelle zunächst mit Hilfe der reversen Transkriptase in DNA-Form gebracht werden. Die Kapazität liegt bei 45kB.

3 Beispiel

Der Klonierungsmechanismus lässt sich vereinfacht am rekombinierten Plasmid darstellen. Zunächst lässt man sowohl den DNA-Doppelstrang, auf dem sich das Transgen befindet, als auch das Plasmid von derselben Restriktionsendonuklease schneiden. So erhält man kompatible Enden, die entweder glatt ("blunt") oder klebrig ("sticky") sind.

Anschließend nimmt das Plasmid das DNA-Insert (Transgen) auf und verknüpft es mit Hilfe der DNA-Ligase unter Ausbildung einer 3'5'-Phosphodiesterbindung. Danach schleust man das rekombinierte Plasmid in ein teilungsfreudiges Bakterium ein (Transformation). Dieses Vorhaben kann man durch Strom-Stimulation anregen.

Nicht alle Plasmide werden von den Bakterienzellen aufgenommen, welche aufgrund dieser Tatsache bei anschließender Beimpfung des Nährbodens mit Breitbandantibiotikum absterben. Die in Bakterienzellen transformierte Plasmide bleiben aufgrund des Resistenzgens bestehen. Zur Trennung der toten und überlebenden Plasmide kann man eine Gelelektrophorese durchführen.

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