DNA-Sequenzierung
Synonym: Genomsequenzierung
Englisch: DNA sequencing
1. Definition
Die DNA-Sequenzierung ist ein molekularbiologisches Analyseverfahren, das die Nukleotidabfolge der DNA bestimmt und so der Entschlüsselung der Erbinformation (Genom oder Gene) von Organismen dient.
2. Verfahren
2.1. Beginn
Zunächst wird der DNA-Abschnitt, dessen Sequenz bestimmt werden soll, an seinem 3’-Ende mit einem komplementären DNA-Oligonucleotid (Primer) hybridisiert. Dieses Oligonukleotid dient der DNA-Polymerase als Primer, so dass diese nach Zugabe der vier Nukleosidtriphosphate einen komplementären Strang produzieren.
2.2. Fortsetzung
Die Verlängerung erfolgt durch einem nucleophilen Angriff der freien Hydroxylgruppe am 3’-Ende an die Phosphorsäureanhydridbindung des Nukleosidtriphosphates. Unter Abspaltung eines Pyrophosphatrestes kommt es zur Verlängerung des Stranges.
2.3. Ende
Teilt man den Sequenzierungsansatz in vier gleiche Teil und gibt 2’,3’-Didesoxyribonukleosid-Triphosphate hinzu, die keine freie Hydroxylgruppe mehr besitzen, kommt es zu einem Kettenabbruch, der sequenzspezifisch ist. Der Abbruch ist aufgrund der Komplementarität ebenfalls basenspezifisch, kann jedoch an jeder beliebigen Position erfolgen.
2.4. Aufklärung der Sequenz
Es folgt die Auftrennung des Gemisches mittels Gelelektrophorese, die unterschiedlich lange Bruchstücke ergibt, die das Ablesen der Base|Basensequenz ermöglichen.
3. Klassische Sequenzierungsmethoden
3.1. Methode von Maxam und Gilbert
Die klassische Methode von Maxam und Gilbert beruht auf der basenspezifischen chemischen Spaltung der DNA durch geeignete Reagenzien. Anschließend erfolgt die Auftrennung der Fragmente durch Gelelektrophorese.
3.2. Didesoxymethode nach Sanger
Die Sequenzierung nach Sanger oder Kettenabbruch-Synthese ist der Goldstandard der Mutationsdetektion in der Genetik. Sie beschreibt Mutationen zuverlässig und erlaubt dadurch Aussagen zu den möglichen Auswirkungen auf die Aminosäuresequenz und ggf. die Sekundärstruktur des kodierenden Proteins. Die möglichen Auswirkungen des Spleißens können nicht immer zuverlässig vorhergesagt werden. Die Limitierung der Sequenzierung (gleich den üblichen PCR-basierten Methoden) betrifft die Detektion größerer Deletionen und genomische Rearrangements. Einer solchen Direktsequenzierung entgehen krankheitsrelevante Mutationen außerhalb der untersuchten Abschnitte (z.B. in großen Introns).
4. Next Generation Sequencing
- Pyrosequenzierung
- Sequenzierung durch Hybridisierung
- Ionen-Halbleiter-DNA-Sequenzierung (Ion-Torrent-Sequenzierung)
- Sequenzierung mit Brückensynthese (Illumina-Sequenzierung)
- Zwei-Basen-Sequenzierung (SOLiD-Sequenzierung)
- Sequenzierung mit gepaarten Enden (SMRT-Sequenzierung)
- Sequenzierung durch Spannungsveränderung (Nanopore-Sequenzierung)
siehe auch: Next Generation Sequencing