DNA-Sequenzierung

Beginn

Zunächst wird der DNA-Abschnitt, dessen Sequenz bestimmt werden soll, an seinem 3’-Ende mit einem komplementären DNA-Oligonucleotid (Primer) hybridisiert. Dieses Oligonukleotid dient der DNA-Polymerase als Primer, so dass diese nach Zugabe der vier Nukleosidtriphosphate einen komplementären Strang produzieren.

Fortsetzung

Die Verlängerung erfolgt durch einem nucleophilen Angriff der freien Hydroxylgruppe am 3’-Ende an die Phosphorsäureanhydridbindung des Nukleosidtriphosphates. Unter Abspaltung eines Pyrophosphatrestes kommt es zur Verlängerung des Stranges.

Ende

Teilt man den Sequenzierungsansatz in vier gleiche Teil und gibt 2’,3’-Didesoxyribonukleosid-Triphosphate hinzu, die keine freie Hydroxylgruppe mehr besitzen, kommt es zu einem Kettenabbruch, der sequenzspezifisch ist. Der Abbruch ist aufgrund der Komplementarität ebenfalls basenspezifisch, kann jedoch an jeder beliebigen Position erfolgen.

Aufklärung der Sequenz

Es folgt die Auftrennung des Gemisches mittels Gelelektrophorese, die unterschiedlich lange Bruchstücke ergibt, die das Ablesen der Base|Basensequenz ermöglichen.

Methode von Maxam und Gilbert

Die klassische Methode von Maxam und Gilbert beruht auf der basenspezifischen chemischen Spaltung der DNA durch geeignete Reagenzien. Anschließend erfolgt die Auftrennung der Fragmente durch Gelelektrophorese.

Didesoxymethode nach Sanger

Die Sequenzierung nach Sanger oder Kettenabbruch-Synthese ist der Goldstandard der Mutationsdetektion in der Genetik. Sie beschreibt Mutationen zuverlässig und erlaubt dadurch Aussagen zu den möglichen Auswirkungen auf die Aminosäuresequenz und ggf. die Sekundärstruktur des kodierenden Proteins. Die möglichen Auswirkungen des Spleißens können nicht immer zuverlässig vorhergesagt werden. Die Limitierung der Sequenzierung (gleich den üblichen PCR-basierten Methoden) betrifft die Detektion größerer Deletionen und genomische Rearrangements. Einer solchen Direktsequenzierung entgehen krankheitsrelevante Mutationen außerhalb der untersuchten Abschnitte (z.B. in großen Introns).

• Pyrosequenzierung
• Sequenzierung durch Hybridisierung
• Ionen-Halbleiter-DNA-Sequenzierung (Ion-Torrent-Sequenzierung)
• Sequenzierung mit Brückensynthese (Illumina-Sequenzierung)
• Zwei-Basen-Sequenzierung (SOLiD-Sequenzierung)
• Sequenzierung mit gepaarten Enden (SMRT-Sequenzierung)
• Sequenzierung durch Spannungsveränderung (Nanopore-Sequenzierung)

siehe auch: Next Generation Sequencing