Nanopore-Sequenzierung
1. Definition
Die Nanopore-Sequenzierung ist eine Methode zur DNA-Sequenzierung. Sie wurde von Oxford Nanopore entwicklelt und stellt eine Weiterentwicklung der Technologie des Next Generation Sequencing dar. Gemessen wird hier die Spannungsveränderung beim Transport der DNA über eine Membran durch eine winzige Pore. Mittels Nanopore kann ein einzelnes DNA-Fragment mit einer Länge bis zu 2 Megabasen sequenziert werden.
2. Eigeschaften
- extrem lange Reads (bis zu 2 Megabasen)
- sehr kurze Laufzeit
- eher hohe Fehlerrate
- hohe Kosten
3. Prinzip
Die Nanopore-Sequenzierung ist eine der wenigen Technologien, die nicht durch kontrollierte DNA-Synthese die Sequenz identifizieren. Die DNA wird durch eine Pore in Nanometergröße (daher die Bezeichnung Nanopore) transportiert. Beim Durchtritt wird die Spannung an dieser Pore verändert. Die Veränderung dieser Spannung ist spezifisch für jede der vier Nukleobasen, wodurch die Sequenz erkennbar ist.
Die Nanopore besteht aus einem rekombinanten Protein, das in eine Polymermembran eingebettet ist. An diese Membran wird eine elektrisches Spannung angelegt. Alles was die Nanopore durchtritt, erzeugt eine Veränderung dieser Spannung. Es existieren mittlerweile aber auch Nanoporen aus Silizium oder Graphen.
Eine Besonderheit der angebotenen Nanopore-Geräte ist ihre Größe. Die meisten besitzen die Größe eines USB-Sticks und können auch direkt mit einem Computer verbunden werden. Die Probenaufbereitung kann so vereinfacht werden, dass die Sequenzierung auch außerhalb eines Labores stattfinden kann.
4. Ablauf
- Die DNA wird fragmentiert (je nach benötigter Read-Länge)
- Ein Enzym verbindet die DNA mit der Nanopore und trennt den Doppelstrang auf.
- Der Einzelstrang wird durch die Nanopore transportiert.
- Beim Durchtritt verändert jede Base die Spannung des Ionenstroms.
- Sobald das Fragment fertig ist, kann das nächste binden.
- Eine Software berechnet aus der Spannungsveränderung die Sequenz der DNA.
5. Video
6. Quellen
- Deschamps, S. et al. Characterization, correction and de novo assembly of an Oxford Nanopore genomic dataset from Agrobacterium tumefaciens. Sci Rep 6, 28625, doi:10.1038/srep28625 (2016).
- Pomerantz, A. et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. Gigascience 7, doi:10.1093/gigascience/giy033 (2018).