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Ion-Torrent-Sequenzierung

1 Definition

Ion Torrent ist eine Technologie zur Sequenzierung der DNA. Sie wurde vom Hersteller ThermoFischer Scientific entwickelt und zählt zum Next Generation Sequencing (NGS). Die Sequenzierreaktion findet auf einem spezifischen Halbleiter-Chip statt. Der Einbau eines Nukleotids kann durch einige leichte pH-Änderung gemessen werden, da bei der Abspaltung von Pyrophosphat auch ein H+-Ion freigesetzt wird. Indem die vier verschiedenen dNTPs nacheinander zugegegeben werden, kann so auf die Sequenz geschlossen werden.

2 Eigenschaften

  • kurze Read-Länge (ca. 200 bp)
  • niedrige Kosten
  • kurze Laufzeiten
  • Skalierbarkeit (die größe der Chips kann verändert werden)
  • höherer Durchfühungsaufwand
  • geringere Verbreitung, weniger Benutzererfahrungen

3 Prinzip

Ion Torrent basiert auf dem Prinzip Sequencing-by-Synthesis (SBS). Es wird die Synthese eines komplementären Stranges schrittweise verfolgt.

Im Unterschied zu anderen NGS-Verfahren basiert Ion Torrent nicht auf optischen Verfahren, es müssen also keine teuren Fluoreszenzlabel oder Enzyme verwendet werden. Davon abgesehen ähnelt die Methode sehr stark der Pyrosequenzierung, nur dass statt Pyrophosphat das H+ aus dieser Reaktion direkt gemessen wird. Da mit dieser Technologie aber kein einzelnes Proton gemessen werden kann, wird auch hier ein Amplifikationsschritt zur Signalverstärkung vorgeschaltet.

4 Ablauf

4.1 Verarbeitung der DNA

Es werden kurze DNA-Fragmente erzeugt.

4.2 Adapter

An die Fragmente werden auf beide Seiten Adapter ligiert

4.3 Emulsions-PCR

Um ein starkes Signal zu erzeugen, müssen die DNA-Fragmente vervielfältigt werden. Dies findet über eine Emulsions-PCR statt (emPCR). In einer Emulsions-PCR findet die PCR in einem Tropfen einer Flüssigkeit statt. Drinnen befinden sich alle Reagenzien für die PCR und das an eine winzige Kugel gebundene DNA-Fragment. Nach der PCR ist die Kugel mit zahlreichen identischen Kopien dieser DNA-Sequenz bedeckt.

4.4 Sequenzierung

Die DNA bedeckten Kugeln werden auf spezifische Sequenzier-Chips aufgebracht. Die Chips bestehen aus vielen kleinen Reaktionskammern (0,5-1 Million). Unterhalb dieser Kammern befindet sich eine Sensorschicht. Diese kann Änderung des pH-Wertes in ein digitales Signal umwandeln. Diese Schicht entspricht der CMOS-Technologie (die auch als Sensor in Kameras verwendet wird), wodurch das Signal jeder Kammer einzeln ausgelesen werden kann.

Es werden nun Schrittweise die vier möglichen dNTPs zugegeben. Wird ein Nukleotid eingebaut, dann verändert sich in dieser Reaktionskammer der pH, was als Spannungsänderung detektiert wird. Die Platte wird gewaschen und das nächste dNTP wird zugegeben. Eine Software berechnet daraus die Sequenz.

5 Quellen

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