Sanger-Sequenzierung
nach Frederick Sanger (1918 bis 2013), britischer Biochemiker und doppelter Nobelpreisträger
Synonym: Didesoxymethode, klassische DNA-Sequenzierung, Kettenabbbruchmethode
Englisch: Sanger sequencing
1. Definition
2. Hintergrund
Unabhängig voneinander haben sich zwei Methoden der DNA-Sequenzierung entwickelt: Die chemische Methode nach Maxam und Gilbert und die besagte Didesoxymethode nach Sanger. Zweitere wurde technisch so weiterentwickelt, dass sie sich weltweit durchgesetzt und bewährt hat, da sie schneller und leichter automatisierbar ist.
Die Sanger-Sequenzierung beruht auf einer In-vitro-Replikation des zu untersuchenden DNA-Moleküls. Voraussetzung hierfür ist jedoch, dass ein Sequenzbereich des Moleküls bereits bekannt ist.[2]
3. Verfahren
Bei der Didesoxymethode geht man von einem markierten Oligodesoxynukleotid-Primer aus, der an den schon bekannten Sequenzbereich des Moleküls hybridisiert. Dabei katalysiert eine DNA-Polymerase in vier parallelen Ansätzen die Synthese des komplementären DNA-Strangs. Diese vier Ansätze sind grundsätzlich identisch - jedoch besitzen sie neben den dNTPs zusätzlich noch eine unterschiedliche Base als 2'-3'-Didesoxynukleotid (ddNTP) in geringer Konzentration. Es ist bekannt, dass eine Kettenverlängerung nur am 3'-OH-Ende eines Nukleotids erfolgen kann. Aufgrund dessen wird die Synthese zum Stillstand kommen, sobald ein ddNTP eingebaut wurde. Das jeweilige ddNTP konkurriert mit dem entsprechenden dNTP, weshalb der Kettenabbruch nach dem Zufallsprinzip an verschiedenen Stellen erfolgt. Dies ist auch der Grund, weshalb man eine Serie an Syntheseprodukten unterschiedlicher Länge erhält.[2]
Der Sequenzierungsvorgang kann grundsätzlich in drei Schritte untergliedert werden:
3.1. Denaturierung
Da anfangs eine doppelsträngige DNA vorliegt, müssen durch Denaturierung (bei etwa 94°C, 1 Minute) die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den gegenläufigen Strängen aufgebrochen werden, um je zwei Einzelstränge zu erhalten.
3.2. Annealing
Der Annealingvorgang dauert 15 Sekunden lang bei 50°C. Hierbei wird (im Gegensatz zur Polymerase-Kettenreaktion) nur ein Primer verwendet, sodass entweder ein forward-primer oder ein reverse-primer bindet.
3.3. Extension
Für die Extensionsreaktion muss die Temperatur für die Taq-Polymerase erneut erhöht werden (60°C, 4 Minuten). Neben der Polymerase verwendet man außerdem eine Mixtur aus vier dNTPs und vier ddNTPs. Hier sind die ddNTPs mit Fluoreszenzmarkern (sog. fluoreszenzmarkierte Terminatoren) ausgestattet, sodass sie in jeweils unterschiedlichen Farben erscheinen (rot, schwarz, grün, blau).
4. Auswertung
Nach durschnittlich 30 Zyklen kann das Verfahren gestoppt werden, sodass es anschließend mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und abgelesen werden kann.[1]