Illumina-Sequenzierung
Synonym: Sequenzierung mit Brückensynthese
Definition
Die Illumina-Sequenzierung ist eine Methode zur Sequenzierung der DNA. Sie wurde vom Hersteller Illumina entwickelt und zählt zum Next Generation Sequencing. Die DNA wird bei diesem Ansatz fragmentiert auf einer Platte aufgetragen und über eine Brücken-PCR vervielfältigt. Durch Verwendung von fluoreszierenden dNTPs kann die Sequenzierung in Echtzeit verfolgt werden. Die dNTPs sind reversible Terminatoren, es wird also immer nur ein Nukleotid einbaut, bevor die Sequenz gemessen wird.
Eigenschaften
- kurze Read-Länge (100 bp)
- weniger Artefakte da reverser Strang ebenfalls sequenziert
- günstige Enzyme
- hoher Durchsatz (120 Gigabasen in zwei Tagen)
- lange Laufzeit
Prinzip
Die Illumina-Sequenzierung folgt dem Prinzip des Sequencing-by-Synthesis. Es wird also die Synthese eines komplementären Stranges Nukleotid-für-Nukleotid verfolgt. Dies ist möglich, da spezielle Nukleotide verwendet werden. Diese dNTPs tragen ein fluoreszierendes Label (jedes mit einer anderen Wellenlänge). Wird ein Nukleotid eingebaut, bricht die Synthese ab, da das Label die Polymerase blockiert. Erst nachdem Enzyme das Label abspalten, kann die nächste Runde beginnen.
Ein entscheidendes Charakteristikum der Illumina-Sequenzierung ist die Art der Signalverstärkung. Das Signal eines einzelnes DNA-Molekül wäre zu schwach um von einer Kamera detektiert zu werden. Deswegen wird vorher eine spezifische PCR durchgeführt. Die DNA wird dazu auf einer spezifischen Platte gebunden und vervielfältigt. Dadurch entstehen Cluster der identischen Sequenz, die ein messbares Signal erzeugen.
Ablauf
Verarbeitung der DNA
Die DNA wird durch mechanische Verfahren fragmentiert. Es entstehen DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 300 bp.
Adapter
An beide Enden des Fragments werden nun Adapter ligiert. Deren Sequenz ist komplementär zu den später verwendeten Primern.
Brücken-PCR
Die Fragmente werden nun über die Adapter auf einer Platte gebunden. Auf dieser Platte befindet sich außerdem ein dichter Rasen von ebenfalls gebundenen Primern, die komplementär zu den Adaptern sind. Die DNA-Fragmente "beugen" sich mit ihrem freien Adapter zu einem Primer hin. Wegen dieser Beugung wird dies als Brücken-PCR bezeichnet. Eine Polymerase beginnt nun ab diesem Primer den komplementären Strang zu synthetisieren. Durch Denaturierung werden diese wieder getrennt.
Es entstehen zwei komplementäre Einzelstränge, ein Forward-Strang und ein Reverse-Strang. Dies ist eine wichtige Eigenschaft der Illumina-Sequenzierung, da Artefakte dadurch leichter identifiziert werden können. Fällt bei der Sequenzierung eine eigenartige Sequenz auf, kann im Gegenstrang geschaut werden, ob diese dort ebenfalls präsent ist.
Dieser Prozess der Amplifizierung wird mehrfach wiederholt. Dadurch entstehen überall auf der Platte unterscheidbare Cluster, die jeweils die identische Sequenz besitzen.
Sequenzierung
Es werden nun ein Primer, die Polymerase und die gelabelten dNTPs zugegeben. Nach dem Einbau eines Nukleotids stoppt die Synthese. Ein Laser regt die fluoreszenten Labels an. Überall auf der Platte leuchtet jeweils das im Cluster eingebaute Nukleotid auf. Die Kamera speichert das Bild. Jeder der einzelnen Cluster wird von der Software registriert.
Ein Enzym spaltet nun das Label ab und das zweite Nukleotid wird eingebaut. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis das Fragment komplett synthetisiert ist.
Quellen
- Anleitung von Illumnina
- Geschichte der Illumina-Sequenzierung
- Mardis, E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016. Nat Protoc 12, 213-218, doi:10.1038/nprot.2016.182 (2017).
- Quail, M. A. et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics 13, 341, doi:10.1186/1471-2164-13-341 (2012).