Amplifikation (PCR)
Synonym: PCR-Amplifikation, DNA-Amplifikation
Englisch: PCR amplification
Definition
Die Amplifikation bezeichnet im Zusammenhang mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die enzymatische Vervielfältigung einer definierten DNA-Zielsequenz. Durch wiederholte Temperaturzyklen wird die Anzahl der Zielsequenz-Kopien exponentiell erhöht, sodass selbst kleinste Ausgangsmengen analytisch nutzbar werden.[1]
Hintergrund
Die PCR wurde Mitte der 1980er Jahre von Kary Mullis entwickelt, der dafür 1993 den Nobelpreis für Chemie erhielt. Das Verfahren läuft in einem Thermocycler ab und besteht aus drei sich wiederholenden Phasen:
- Denaturierung (ca. 94–96 °C): Die Doppelstrang-DNA wird in Einzelstränge aufgetrennt.
- Primerhybridisierung (Annealing, ca. 50–65 °C): Kurze synthetische Oligonukleotide (Primer) binden sequenzspezifisch an die komplementären Abschnitte der Ziel-DNA.
- Elongation (ca. 72 °C): Eine hitzestabile DNA-Polymerase (meist Taq-Polymerase) synthetisiert ausgehend von den Primern den neuen komplementären Strang.
Nach 25–40 solcher Zyklen liegt die Zielsequenz theoretisch in 2n-facher Kopienzahl vor (n = Anzahl der Zyklen).
Varianten
Konventionelle PCR
Das Produkt (Amplikon) wird nach Abschluss der Reaktion mittels Gelelektrophorese nachgewiesen. Eine Quantifizierung der Ausgangsmenge ist dabei nur eingeschränkt möglich.
Realtime PCR (qPCR)
Bei der quantitativen Realtime-PCR wird die Produktmenge während der laufenden Reaktion durch Fluoreszenzmessung kontinuierlich erfasst. Der sogenannte Ct-Wert (cycle threshold) gibt an, nach wie vielen Zyklen das Fluoreszenzsignal einen definierten Schwellenwert überschreitet – je höher die Ausgangsmenge, desto niedriger der Ct-Wert. Diese Methode ermöglicht eine präzise Quantifizierung.[1]
Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR)
Zur Amplifikation von RNA-Sequenzen (z. B. mRNA, virale RNA) wird bei der RT-PCR die RNA zunächst durch eine Reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben, die dann als PCR-Matrize dient.
Multiplex-PCR
Durch Verwendung mehrerer Primerpaare in einem einzigen Ansatz können bei der Multiplex-PCR gleichzeitig mehrere Zielsequenzen amplifiziert werden, was den Probendurchsatz erhöht.
Klinische Relevanz
Die PCR-Amplifikation ist heute ein unverzichtbares Werkzeug in Diagnostik und Forschung, Sie wird u.a. in folgenden Bereichen verwendet
- Infektionsdiagnostik: Nachweis von Bakterien, Viren und Pilzen (z. B. SARS-CoV-2, HIV, Pneumocystis jirovecii) aus klinischen Proben[2]
- Onkologie: Detektion von Genmutationen, Translokationen, zirkulierender Tumor-DNA und minimaler Resterkrankung (MRD)
- Pränataldiagnostik: Nachweis genetischer Varianten aus Chorionzotten- oder Fruchtwasser-Material, nicht-invasive Pränataldiagnostik
- Forensik: DNA-Typisierung aus Spurenmaterial
Aufgrund der hohen Sensitivität der PCR können bereits geringste Kontaminationen mit Fremd-DNA zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Strikte Laborhygiene und räumliche Trennung von Prä- und Post-PCR-Bereichen sind daher essenziell.
Quellen
- ↑ 1,0 1,1 Kubista M et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 2006;27(2-3):95-125.
- ↑ McDonald C et al. PCR in Forensic Science: A Critical Review. Genes (Basel). 2024;15(4):438.