Realtime-PCR

Synonym: kinetische PCR, quantitative PCR
Abkürzung: RT-PCR, qPCR
Deutsch: Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit

1 Definition

Die Realtime-PCR ist eine Nukleinsäure-Amplifikationstechnik (NAT), bei der die Vervielfältigung der DNA-Sequenz in Echtzeit beobachtet werden kann.

Die Abkürzung RT-PCR wird auch für die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion verwendet, hierbei handelt es sich aber um eine andere Technik.

2 Methode

Bei älteren PCR-Methoden wie der PCR mit Sequenz-spezifischen Primern (SSP-PCR) wird die Polymerase-Kettenreaktion für eine bestimmte, vorher festgelegte Anzahl von Zyklen durchgeführt und dann festgestellt, ob das gesuchte Genprodukt vorhanden ist, d. h. amplifiziert wurde, oder nicht.

Bei der Realtime-PCR wird nach jedem Amplifikationszyklus die Menge der entstandenen DNA analysiert. Dadurch kann eine Aussage über die Kinetik der Amplifikationsreaktion gemacht werden.

Technisch gibt es zwei Verfahren, um die Menge der neu entstandenen DNA zu messen:

• Bei der unspezifischen Methode wird ein Färbemittel verwendet, das sich an alle doppelsträngige DNA (dsDNA) in der Probe anlagert, z.B. SYBR Green. Durch die Anlagerung an die DNA (Interkalierung) kommt es zur Fluoreszenz. Die Messwerte können allerdings durch Anwesenheit anderer, unspezifisch amplifizierter dsDNA-Abschnitte in der Probe verfälscht werden. Die Reaktion muss deshalb sorgfältig aufgebaut werden, um die Amplifikation so spezifisch wie möglich zu halten.
• Bei der spezifischen Methode werden so genannte "Gensonden" (engl.: probes) verwendet. Das sind kurze DNA-Abschnitte, die komplementär zu der gesuchten Sequenz sind und mit einem Fluoreszenzfarbstoff ("Reporter") sowie einem Fluoreszenzlöscher ("Quencher") markiert wurden. Durch eine Wechselwirkung zwischen Reporter und Quencher, den so genannten fluorescence resonance energy transfer (FRET), wird die Fluoreszenz unterdrückt. Die Gensonde lagert sich im Verlauf der PCR downstream des Primers an ein komplementäres Stück DNA an und wird dann durch die Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase abgebaut. Dabei wird der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt und aktiviert, da die Unterdrückung durch den Quencher entfällt. Durch Anregung der Probe mit Licht einer geeigneten Wellenläge kann dann die entstehende Fluoreszenz gemessen werden.

Ein Realtime-PCR-Gerät kombiniert einen Thermocycler mit einem Fluoreszenz-Analysator. Die Geräte verfügen in der Regel mehrere Fluoreszenzkanäle, das heißt in demselben Testansatz können bei Einsatz der spezifischen Methode mehrere Zielsequenzen parallel analysiert werden (Multiplex-PCR). Auf diese Weise lassen sich einerseits mehrere Untersuchungen in einem Ansatz durchführen. Andererseits ist damit die gleichzeitige Messung von Kontrollen oder Standards möglich, über die das PCR-Ergebnis auch quantifiziert werden kann.

Inzwischen sind stark vereinfachte Realtime-PCR-Geräte auf dem Markt, die praktisch ohne Probenvorbereitung auskommen und dadurch sogar in der patientennahen Sofortdiagnostik eingesetzt werden können.