Threshold Cycle

Bei der Realtime-PCR wird die zunehmende Menge an Nukleinsäure, die durch die vielfach hintereinander ablaufenden Amplifikationszyklen entsteht, durch einen Fluoreszenzfarbstoff sichtbar gemacht. In einem Diagramm, bei dem auf der X-Achse die Anzahl der Zyklen und auf der Y-Achse die Fluoreszenzintensität aufgetragen wird, zeigt sich ein sigmoidaler Kurvenverlauf. Die Reaktionskinetik ähnelt dabei den Wachstumsphasen einer Bakterienkultur.

In dem Beispieldiagramm sind 9 Reaktionskurven eines Realtime-PCR-Laufes dargestellt. 8 Kurven gehören zu 4 Standardlösungen, die in Doppelbestimmung gemessen wurden, die neunte Kurve (rosa, fett dargestellt) ist eine Probe, deren Anzahl an DNA-Kopien ermittelt werden soll. Die waagerechte rote Linie ist die Threshold oder Schwelle. Sie liegt knapp oberhalb des waagerechten Kurvenbereiches während der ersten Zyklen. Die Kurvenverläufe der jeweiligen Doppelmessungen sind zwar unterschiedlich, der Threshold Cycle liegt aber jeweils eng beieinander bei den Zyklen 17, 22, 25 und 28.

Der C_t-Wert stößt aktuell (2020) im Rahmen der COVID-19-Pandemie auf gesteigertes Interesse, da man versucht, damit das Ergebnis von positiven SARS-CoV-2-Untersuchungen weiter zu interpretieren. Ein niedriger Threshold Cycle spricht für eine hohe Viruslast, ein hoher Wert dagegen für eine geringe RNA-Konzentration. Dies könnte, abhängig von Anamnese und Symptomen, entweder für eine frühe Infektion oder für eine späte Krankheitsphase mit geringer Infektiosität sprechen. Da die Ergebnisse stark von der Qualität des Rachenabstriches abhängen und zudem bei verschiedenen Geräten und Assays unterschiedlich sein können, ist dies aber nur ein Schätzwert.

Viele Labore sind inzwischen dazu übergegangen, den Ct-Wert auf dem Befund der Realtime-PCR anzugeben. Laut Informationen u.a. des Robert-Koch-Institutes geht bei einem Threshold Cycle >30 die Anzüchtbarkeit des Virus zunehmend verloren.^[1][2]

Um die Konzentration der Ziel-DNA bzw. RNA im Probenmaterial quantitativ zu bestimmen, kann mit Hilfe von Standards (Kalibratoren) mit bekannter Konzentration im Reaktionsansatz eine Eichkurve erstellt werden. Dieses Verfahren wir bei vielen Laboruntersuchungen, z. B. Immunoassays, regelmäßig angewandt.

Diese Abbildung zeigt dieselben Daten wie die das obere Bild, allerdings ist das Fluoreszenzsignal gegen eine logarithmische Skala aufgetragen. Dadurch wird die Darstellung im Bereich der niedrigen Werte gespreizt, im Bereich der hohen Werte dagegen gestaucht. Wie gesagt wurden die Standards in Doppelbestimmung gemessen, um Ausreißer erkennen zu können. Die vorgelegten Konzentrationen sind 4 x 10⁷, 4 x 10⁶, 4 x 10⁵ und 4 x 10⁴ Genomäquivalente, in diesem Beispiel DNA von Chlamydia trachomatis.

Die Berechnung wird von der Software automatisch durchgeführt. Unten rechts ist die errechnete Eichkurve (standard curve) abgebildet, in der Tabelle unten links die vorgegebenen Konzentrationen der Standards (given conc), die aus der Eichkurve rückgerechneten Konzentrationen (calc conc) und die Konzentration einer Probe mit unbekannter DNA-Konzentration (unknown). Aus dem Threshold Cycle von 25,56 ergibt sich eine Kopienzahl von 3,17 x 10⁵. Obwohl das Gerät mit diskreten Amplifikationszyklen arbeitet, wird der interpolierte Ct-Wert mit Kommastellen angegeben.