cDNA

Die Synthese erfolgt mithilfe einer reversen Transkriptase. Unter Verwendung einer RNA als Matrize sowie in Anwesenheit der vier 2'-Desoxyribonukleosid-5'-triphosphate (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) als Substrate und eines Oligonukleotid-Primers, der komplementär zum 3'-Endbereich der RNA ist, wird eine DNA synthetisiert, die komplementär zur RNA-Vorlage ist. Der verwendete Primer kann zufällig sein, also aus einem Gemisch kurzer, einzelsträngiger Nukleotide mit zufälliger Sequenz bestehen (z.B. Hexamere). Bei eukaryotischer mRNA eignen sich zur cDNA-Synthese auch Oligo(dT)-Primer, da eukaryotische mRNAs am 3'-Ende charakteristische poly(A)-Sequenzen (Poly-A-Schwanz) tragen, die als Vorlage für die RT-Reaktion genutzt werden können.

Der synthetisierte cDNA-Strang hybridisiert zunächst mit der mRNA, die anschließend enzymatisch abgebaut wird. In einem zweiten Schritt wird die einzelsträngige cDNA durch eine DNA-abhängige DNA-Polymerase zu einer doppelsträngigen cDNA ergänzt. Diese cDNA entspricht dem Strukturgen, von dem die RNA abgeleitet wurde.

cDNA enthält im Vergleich zur genomischen DNA keine flankierenden Bereiche und keine Introns, da sie in ihrer Sequenz der mRNA entspricht. Diese Eigenschaft wird für die Klonierung von Genen und deren Expression in heterologen Systemen genutzt. So können Proteine auch in Organismen synthetisiert werden, die kein Spleißen durchführen.

In der Molekularbiologie werden sogenannte cDNA-Bibliotheken aus bestimmten Zellen oder Geweben angelegt. Im Idealfall enthält die Bibliothek das gesamte Transkriptom (die Gesamtheit aller exprimierten Gene) in Form von cDNA. cDNA ist für dafür besser geeignet als mRNA, da diese sehr viel stabiler ist.

Die Kombination aus reverser Transkriptase und anschließender PCR wird als Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) bezeichnet. Allerdings wird die Abkürzung RT-PCR auch für die Real-Time-PCR verwendet, was zu Verwechslungen führen kann.