Transcription Activator-like Effector Nuclease
Abkürzung: TALEN
1. Definition
Transcription Activator-like Effector Nucleases, kurz TALENs, sind rekombinante Restriktionsenzyme, die als molekulare Scheren beim Genom-Editing angewendet werden. Diese Enzyme können so synthetisiert werden, dass sie sequenzspezifisch ein Gen an einer definierten Stelle ausschalten.
2. Prinzip
Die verwendeten Enzyme bestehen aus zwei Domänen:
- einer unspezifischen Nukleasendomäne
- einer sequenzspezifischen DNA-bindenden Domäne
Die DNA-bindende Domäne kann so angepasst werden, dass sie theoretisch an jede Sequenz innerhalb des Genoms bindet. Dadurch wird die Nukleasendomäne so platziert, dass sie dort die DNA schneidet und ein Doppelstrangbruch entsteht. Dieser Doppelstrangbruch wird zwar sofort durch die Zelle repariert, jedoch meist mittels unpräziser Reparaturmechanismen wie der nicht-homologen Endverknüpfung (NHEJ). Diese kann beim Zusammenfügen der Stränge einige Nukleotide entfernen oder hinzufügen (Deletionen und Insertionen). Entstehen die Mutationen an einer essentiellen Position, kommt es zu einem erfolgreichen Knockout des betreffenden Gens.
3. Design der Bindungsstelle
Zuerst wird eine Zielstelle im Genom ausgewählt. Die erforderliche Länge ist von der berechneten Spezifität abhängig, üblicherweise meist 15-30 bp. Die DNA-bindende Domäne der Nukleasen muss so angepasst werden, dass sie an diese Sequenz bindet. Dies wird durch Kombination von verschiedenen Modulen (TALEs) ermöglicht. Jedes dieser Module besitzt zwei Aminosäuren, die spezifisch ein Nukleotid erkennen. Pro Nukleotid ist daher ein Modul erforderlich. Diese Zusammenstellung wird mittels Klonierung von verschiedenen bekannten Modulsequenzen durchgeführt.
Über ein Plasmid kann dieses Konstrukt in die Zielzelle eingebracht werden.
4. Vergleich mit CRISPR/Cas
Das CRISPR/Cas-System verwendet einen vergleichbaren Ansatz, um zielgerichtet Mutationen in Gene einzuführen. Hier wird eine Nuklease (Cas) durch eine sequenzspezifische RNA (Guide-RNA) zur gewünschten Stelle gebracht. Durch einen Doppelstrangbruch und anschließender fehleranfälliger Reparatur werden auf identische Weise Mutationen erzeugt.
Die Methoden unterscheiden sich vor allem hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit und Spezifität. Alle Genom-Editing-Verfahren tragen auch immer das Risiko, an einer anderen Stelle durch unspezifische Effekte weitere Veränderungen in die DNA einzuführen. Diese werden als Off-target-Mutationen bezeichnet. Hier hat sich bisher TALENs als zuverlässiger erwiesen. Dies ist insbesondere für eine potentielle Anwendung in einer Gentherapie relevant.
TALENs kann außerdem für jede Gensequenz angepasst werden. CRISPR-Cas ist auf Abschnitte limitiert, die eine bestimmte 3-Basen Abfolge besitzen (PAM-Sequenz). Im Vergleich zu CRISPR/Cas ist TALENs jedoch aufwendiger.
5. Quellen
- Joung, J. Keith, and Jeffry D. Sander. “TALENs: A Widely Applicable Technology for Targeted Genome Editing.” Nature reviews. Molecular cell biology 14.1 (2013): 49–55. PMC. Web. 21 Oct. 2018.
- Cermak T, Doyle EL, Christian M, et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Research. 2011;39(12):e82. doi:10.1093/nar/gkr218.