Guide-RNA

Guide-RNA beinhaltet genetische Informationen, die in der DNA nicht enthalten sind, die jedoch für ein Protein wichtig sind und deshalb noch in die mRNA eingefügt werden müssen. Dabei katalysiert nicht sie selbst den Vorgang des Einfügens, sondern dirigiert nur die dafür benötigten Enzyme an den Ort ihres Wirkens.

Dazu lagert sich die Guide-RNA mit ihrer Sequenz an eine prä-mRNA an. Dabei gibt es jedoch keine komplette Übereinstimmung der RNA-Sequenzen, da die Guide-RNA mehr Basen enthält. Dieser Mismatch wird von Endonukleasen erkannt, welche die prä-mRNA spalten und dadurch Lücken auf dem prä-mRNA-Transkript bilden. Eine entsprechende Polymerase füllt nun die fehlenden Basen wieder auf, als Matrize wird dabei die Guide-RNA verwendet. Eine Ligase verknüpft die enstandenen Lücken. Die fertig editierte mRNA kann nun entweder weiter modifiziert werden oder wird in das Zytoplasma transportiert, um dort von einem Ribosom translatiert zu werden.

CRISPR/Cas basiert auf 2 Komponenten: der Guide-RNA (gRNA) und der unspezifischen, CRISPR-assosziierten Endonuklease (Cas9). Die Guide-RNA ist eine kurze synthetische RNA-Sequenz, die einen Molekülteil für die Bindung von Cas9 enthält sowie eine anwenderdefinierte Targetsequenz von etwa 20 Nukleotiden, die das Gen adressiert, das verändert werden soll. Bei der Auswahl der Targetsequenz muss beachtet werden, dass diese 5' vor einer PAM-Sequenz liegt. Für Cas9 lautet die PAM-Sequenz -NGG, d.h. auf ein beliebiges Nukleotid (N) müssen zwei Guanin-Nukleotide (G) folgen.