Methylierungsanalyse
Definition
Die Methylierungsanalyse ist eine molekularbiologische Methode zur Untersuchung epigenetischer Modifikationen der DNA, insbesondere der Methylierung von Cytosin. Dabei handelt es sich um die chemische Modifikation von Cytosinbasen durch Anhängen einer Methylgruppe an das Kohlenstoffatom in Position 5 des Pyrimidinrings, was zur Bildung von 5-Methylcytosin (5-mC) führt.
Hintergrund
Die DNA-Methylierung ist ein zentraler epigenetischer Regulationsmechanismus. Er beeinflusst maßgeblich die Genexpression, die chromosomale Stabilität sowie die Zelldifferenzierung. In Säugetierzellen tritt Methylierung nahezu ausschließlich im Kontext von CpG-Dinukleotiden auf. Besonders relevant ist die Methylierung in Promotorregionen. Eine hohe Methylierungsdichte in diesen Bereichen korreliert in der Regel mit einer Herunterregulierung des jeweiligen Gens, die als Silencing bezeichnet wird. Der Grund dafür ist, dass die Methylierung die Bindung von Transkriptionsfaktoren sowie die Zugänglichkeit der DNA für die Transkriptionsmaschinerie einschränkt.
Methode
Zur experimentellen Erfassung von Methylierungsmustern wird typischerweise die Natriumbisulfit-Konversion eingesetzt. Dieses Verfahren basiert auf der selektiven chemischen Umsetzung von nicht-methylierten Cytosinen zu Uracil, während methyliertes Cytosin gegenüber dieser Reaktion stabil bleibt.
Ablauf:
- Bisulfitbehandlung: Die Genom-DNA (im einzelsträngigen Zustand) wird mit Natriumbisulfit inkubiert. Dabei wird nicht-methyliertes Cytosin zu Uracil desaminiert. 5-Methylcytosin bleibt unverändert.
- Amplifikation und Sequenzierung: Die bisulfitbehandelte DNA dient als Matrize für eine PCR-Amplifikation. In der nachfolgenden DNA-Sequenzierung wird Uracil als Thymin (T) detektiert, während 5-Methylcytosin weiterhin als Cytosin (C) erscheint. So werden in der PCR-Produktion alle ehemals unmethylierten "C"-Stellen als "T" repräsentiert. Der Vergleich der Sequenzdaten mit der unbehandelten Referenzsequenz erlaubt eine positionsgenaue Kartierung des Methylierungsmusters.
Methodenvarianten:
Bedeutung
Die Methylierungsanalyse hat vielfältige Anwendungen in Forschung und klinischer Diagnostik:
- Onkologie: Detektion tumorspezifischer Methylierungsmuster (z.B. MLH1, MGMT)
- Entwicklungsbiologie: Analyse differenzierungsabhängiger epigenetischer Regulation
- Epigenetische Alterungsforschung: Bestimmung "epigenetischer Uhren"
- Pränatale Diagnostik und Imprinting-Erkrankungen
Literatur
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