DNA-Methylierung

Es existieren drei verschiedene Methyl-Modifikationen der DNA:

• N6-Methyladenin (m6A): katalysiert durch DNMTs der EC-Klassifikation 2.1.1.72
• N4-Methylcytosin (m4C): katalysiert durch DNMTs der EC-Klassifikation 2.1.1.113
• 5-Methylcytosin (m5C): katalysiert durch DNMTs der EC-Klassifikation 2.1.1.37 (beim Menschen DNMT1, DNMT3A und DNMT3B)

Bei Eukaryoten kommt vorwiegend die m5C-Modifikation vor, die meist an CpG-Dinukleotiden auftritt. Die Modifikation liegt symmetrisch auf beiden DNA-Strängen und ihr Erhalt nach der DNA-Replikation wird durch die Maintenance-Methyltransferasen gewährleistet. Dies ist ein grundlegender Mechanismus der Epigenetik.

In Säugetieren sind etwa 75 % der CpG-Dinukleotide in adulten, somatischen Zellen methyliert. Die Methylierung der DNA bewirkt eine Verdichtung des Chromatins und inhibiert somit die Transkription.

Die anderen beiden DNA-Modifikationen, m6A und m4C, treten überwiegend in prokaryotischer DNA auf.

Die Konsequenzen der Methylierung zeigen sich bei der Regulierung der Genexpression deutlich: Methylierte Cytosine in der Promotorregion eines Gens führen zu seiner Inaktivierung und agieren somit als "Ausschalter". Die Inaktivierung basiert auf der Inhibition der Bindung von Transkriptionsfaktoren sowie der Rekrutierung von Methyl-CpG-bindenden Proteinen (z.B. MeCP2). Dieses Phänomen verhindert, dass alle Gene in einem Gewebe oder einer Zelle gleichzeitig exprimiert werden.

Die Methylierungsmuster sind zelltypspezifisch und dynamisch reguliert. So trägt die DNA-Methylierung zur Zelldifferenzierung und Entwicklung bei. Weiterhin spielt sie eine Rolle bei der genomischen Stabilität, dem Imprinting und der Inaktivierung des X-Chromosoms bei Frauen.

Da im Genom alle Cytosine in einem CpG-Kontext bekannt sind, lassen sich durch eine Methylierungsanalyse sowohl gewebe- als auch krankheitsspezifische Muster identifizieren. Sie ermöglichen die Diagnose von Erkrankungen zu einem sehr frühen Zeitpunkt und erlauben ihre molekulare Klassifizierung.

Fehlregulationen der DNA-Methylierung stehen im Zusammenhang mit:

• Krebserkrankungen
  • Hypermethylierung von Tumorsuppressorgenen
  • Hypomethylierung repetitiver Sequenzen → genomische Instabilität
• Imprinting-Störungen
  • z.B. Prader-Willi- oder Angelman-Syndrom
• Neuropsychiatrische Erkrankungen
  • z.B. Rett-Syndrom (Mutation im MeCP2-Gen)
• Alterungsprozesse und epigenetische Uhren
  • DNA-Methylierungsprofile dienen als Biomarker des biologischen Alters
• Prädiktive und diagnostische Biomarker
  • z.B. SEPT9-Methylierung als Marker für Darmkrebs

Der Goldstandard für Einzelbasenauflösung ist die Bisulfit-Sequenzierung. Dieses Verfahren basiert auf der selektiven chemischen Umsetzung von nicht-methylierten Cytosinen zu Uracil durch Zugabe von Natriumbisulfit, während methyliertes Cytosin gegenüber dieser Reaktion stabil bleibt. Der Vergleich der Sequenzdaten mit der unbehandelten Referenzsequenz erlaubt eine positionsgenaue Kartierung des Methylierungsmusters.

Varianten der Methode sind:

• Pyrosequenzierung
• Methylierungs-spezifische PCR (MSP)
• Gesamtgenom-Bisulfit-Sequenzierung (WGBS)
• Targeted BS-Seq
• Oxidative Bisulfit-Sequenzierung (oxBS-Seq; zusätzliche Identifikation von 5-Hydroxymethylcytosin)

Bei dieser Methode werden die der Schnittmuster von Isoschizomeren verglichen, die unterschiedlich auf methylierte DNA reagieren (z.B. HpaII vs. MspI).

Die MeDIP-Seq basiert auf der Immunpräzipitation methylierter DNA mit Antikörpern gegen 5-Methylcytosin. Die Kombination mit einer anschließenden Sequenzierung erlaubt ein genomweites Profiling.

Arrays können für die Hochdurchsatzanalyse von bis zu 850.000 CpG-Stellen (z.B. Illumina Infinium MethylationEPIC) verwendet werden. Sie sind standardisiert und werden vor allem für klinische und epidemiologische Studien eingesetzt.