Bisulfit-Sequenzierung
Englisch: bisulfite sequencing, bisulphite sequencing
Definition
Die Bisulfit-Sequenzierung, kurz BS-Seq, ist eine molekularbiologische Methode zum positionsgenauen Nachweis von 5-Methylcytosin (5-mC) in der DNA. Sie basiert auf der selektiven chemischen Umsetzung nicht-methylierter Cytosinbasen durch Natriumbisulfit, während 5-methylierte Cytosine gegenüber dieser Reaktion weitgehend inert sind.
Hintergrund
Nicht-methylierte Cytosine werden durch eine mehrstufige Reaktion in Uracil überführt. Während der anschließenden PCR wird Uracil als Thymin amplifiziert. Durch den Vergleich der behandelten Sequenz mit einer unbehandelten Referenzsequenz kann das Methylierungsmuster einzelner Cytosinpositionen präzise bestimmt werden.
DNA-Methylierung stellt eine zentrale epigenetische Modifikation dar. Beim Menschen erfolgt sie überwiegend an Cytosinresten in CpG-Dinukleotiden. Repetitive genomische Sequenzen sind meist stark methyliert. Promotorassoziierte CpG-Inseln sind in gesunden Zellen in der Regel unmethyliert, können jedoch bei pathologischen Prozessen – z.B. in Tumoren – hypermethyliert sein.
DNA-Methylierung beeinflusst die Chromatinstruktur, Transkriptionsaktivität und Differenzierungsprozesse. Störungen des Methylierungsmusters sind mit zahlreichen Erkrankungen assoziiert, insbesondere mit malignen Neoplasien.
Verfahren
Die Bisulfit-Reaktion verläuft in drei Schritten:
- Sulfonierung des Cytosins an Position 6
- Hydrolytische Desaminierung zu einem Uracil-Sulfonat
- Desulfonierung unter alkalischen Bedingungen
5-Methylcytosin reagiert deutlich langsamer als unmethyliertes Cytosin und bleibt unter typischen Reaktionsbedingungen weitgehend erhalten.
Indikationen
Die Bisulfit-Sequenzierung wird u.a. diagnostisch eingesetzt zur bzw. zum
- Detektion tumorspezifischer Methylierungsmuster (Glioblastom)
- Nachweis von Imprinting-Defekten (Prader-Willi-Syndrom, Angelman-Syndrom, Beckwith-Wiedemann-Syndrom)
- Spermienfunktionsdiagnostik (in Einzelfällen)
Varianten
Moderne Weiterentwicklungen der Bisulfit-Sequenzierung umfassen:
- Whole-Genome Bisulfite Sequencing (WGBS) – Analyse des gesamten Genoms
- Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) – Anreicherung CpG-reicher Regionen
- Targeted Bisulfite Sequencing – Untersuchung definierter Genabschnitte
- Oxidative Bisulfite Sequencing (oxBS) – Differenzierung zwischen 5-mC und 5-Hydroxymethylcytosin (5-hmC)
Limitationen
Zu den Limitationen der Bisulfit-Sequenzierung zählen eine teilweise DNA-Degradation durch die chemische Behandlung sowie das Risiko einer unvollständigen Konversion nicht-methylierter Cytosine, was zu falsch-positiven Methylierungssignalen führen kann. Darüber hinaus können PCR-bedingte Verzerrungen das Ergebnis beeinflussen.
Referenzen
- Frommer et al., A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands, Proc Natl Acad Sci U S A. 1992
- Clark et al., High sensitivity mapping of methylated cytosines, Nucleic Acids Res, 1994