Enzym-Assay

In Enzym-Assays wird die Aktivität eines Enzyms gemessen. Hierfür wird das Enzym mit seinem Substrat zusammen pipettiert und der Umsatz des Substrates gemessen, indem entweder die Abnahme des Substrats oder die Zunahme des Produkts gemessen wird.

Es gibt verschiedene Methoden, den Umsatz zu bestimmen. Die Auswahl hängt vom Substrat oder Produkt der beobachteten Reaktion ab:

• Photometrie
• Fluorimetrie
• Circulardichroismus
• optische Rotationsdispersion
• Turbidimetrie
• Luminometrie
• Messung der Radioaktivität bei Verwendung radioaktiv markierter Substanzen
• elektrochemische Methoden

Während des Assays werden in bestimmten Zeitabständen Proben entnommen, die vermessen werden. Vor der Vermessung werden sie gequencht, d.h. die Reaktion gestoppt. Dies geschieht i.d.R. durch die Zugabe von Trichloressigsäure, die das Protein denaturiert.

Da sich Enzyme und auch verschiedene Protein-Chargen untereinander stark in ihrer Aktivität unterscheiden können, müssen Enzymassays standardisiert werden. Vor allem, wenn die Ergebnisse aus verschiedenen Assays verglichen werden sollen, ist es wichtig, dass bestimmte Parameter identisch sind, da sie die Aktivität des Enzyms stark beeinflussen. Es sind vor allem folgende Parameter zu berücksichtigen:

• pH-Wert: Normalerweise wird der pH-Wert des pH-Optimums ausgewählt. Manchmal ergibt sich jedoch auch ein Gegensatz zwischen pH-Optimum und dem physiologischen pH (7,4), der die Aktivität in vivo am besten widerspiegelt.
• Puffer und Ionenstärke: Um den pH-Wert in der Lösung über die Reaktionszeit konstant zu halten, muss ein Puffer eingesetzt werden, dessen Pufferbereich dem gewünschten pH-Wert entspricht. Normalerweise wird eine Pufferkonzentration von 0,1 mol/l eingesetzt. Manche Enzyme, vor allem solche aus halo- oder thermophilen Organismen, benötigen eine hohe Ionenstärke, um optimal funktionieren zu können.
• Temperatur: Da die Temperatur die Reaktionsgeschwindigkeit stark beeinflusst (siehe RGT-Regel), sollte eine definierte Temperatur ausgewählt werden. In der Regel werden drei Temperaturen verwendet:
  • 25 °C: sind einfach aufrechtzuerhalten, ergeben aber oft eine niedrige enzymatische Aktivität.
  • 37 °C: entsprechen der Körpertemperatur und geben somit die Aktivität im lebenden Organismus am ehesten wieder. Jedoch ist die Durchführung aufwendiger, da alle verwendeten Lösungen auf die Temperatur erwärmt und konstant gehalten werden müssen.
  • 30 °C: stellen einen Kompromiss aus den beiden anderen Temperaturen dar.

Daneben werden manchmal abweichende Temperaturen eingesetzt, wenn z.B. Enzyme aus psychrophilen und thermophilen Organismen untersucht werden.

• Konzentrationen der Substrate und Cofaktoren: Das Substrat sollte in einer sättigenden Konzentration eingesetzt werden, d.h. dass sich die Konzentration des Substrates über den Reaktionsverlauf nicht nennenswert ändert. Aus diesem Grund sollte die Konzentration mindestens das Zehnfache der Michaelis-Menten-Konstante und das Fünffache der Enzymkonzentration betragen.
• Enzymkonzentration: Sie sollte so gering wie möglich gehalten werden, da auf diese Weise weniger Substrat benötigt wird, aber dennoch so hoch sein, dass ein Umsatz gut beobachtet werden kann.
• Konzentration von Additiven: Als Additive können Stabilisatoren, Antioxidanzien, Proteaseinhibitoren, Komplexbildner, Tenside u.ä. eingesetzt werden. Ihre Konzentration sollte so gewählt werden, dass der Enzymumsatz am besten beobachtet werden kann. Es ist jedoch zu beachten, dass sie auch den pH-Wert, die Ionenstärke oder andere Parameter verändern können.

Die Bedingungen des jeweiligen Assays müssen so genau wie möglich angegeben sein, um eine Vergleichbarkeit gewährleisten zu können.

Enzymassays werden verwendet, um Enzymkinetiken zu bestimmen (siehe Michaelis-Menten-Theorie). Hierfür werden Ansätze mit verschiedenen Konzentrationen eines Substrates angesetzt und vermessen. Die Änderung der Konzentration des Produkts entspricht der Reaktionsgeschwindigkeit. Wird diese gegen die jeweilige Konzentration an Substrat aufgetragen, erhält man eine Michaelis-Menten-Kurve, aus der enzymatische Parameter wie Wechselzahl und die Michaelis-Menten-Konstante bestimmt werden können. Auf diese Weise kann auch die spezifische Aktivität einer Protein-Charge bestimmt werden.

In der Arzneimittelforschung werden Enzymassays in Gegenwart von Inhibitoren durchgeführt. Hierdurch wird die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms verringert und es kann die Affinitäts- oder Hemmkonstante des Inhibitors berechnet werden. So lässt sich überprüfen, ob die Stärke der Verbindung noch angepasst werden muss.

• Bisswanger, H. (2014). Enzyme assays. Perspectives in Science, 1(1-6), 41–55.