Western Blot: Unterschied zwischen den Versionen
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Vor dem eigentlichen Western Blot muss das Proteingemisch aufgetrennt werden. Ein Beispiel wäre hier die [[SDS-PAGE]], bei dem die Proteine im elektrischen Feld entsprechend ihrer Größe unterschiedlich weit auf einem [[Polyacrylamid]]-Gel wandern. Nachdem die Proteine nun 'sortiert' sind werden sie mit Hilfe eines weiteren elektrischen Feldes, | Vor dem eigentlichen Western Blot muss das Proteingemisch aufgetrennt werden. Ein Beispiel wäre hier die [[SDS-PAGE]], bei dem die Proteine im elektrischen Feld entsprechend ihrer Größe unterschiedlich weit auf einem [[Polyacrylamid]]-Gel wandern. Nachdem die Proteine nun 'sortiert' sind, werden sie mit Hilfe eines weiteren elektrischen Feldes, das senkrecht zu dem Gel steht, auf eine PVDF- oder Nitrocellulose-Membran übertragen. | ||
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Anschließend werden zwei verschiedene Antikörper auf die Membran gegeben. Die Primärantikörper | Die Proteinbanden sind nun fest auf der Membran gebunden und können mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden. Am häufigsten werden hier [[Antikörper]] verwendet, die an ein bestimmtes Protein (z.B. Virusprotein) binden. Damit ein Ergebnis zustande kommt, müssen vorher die freien Bindungsstellen auf der Membran mit Proteinen, die nicht von Antikörpern erkannt werden können, blockiert werden. Dazu behandelt man die Membran z.B. mit [[Bovines Serumalbumin|Bovinem Serumalbumin]] oder einer Milchpulver-Lösung. | ||
Anschließend werden zwei verschiedene Antikörper auf die Membran gegeben. Die [[spezifisch]]en [[monoklonal|mono-]] oder [[polyklonal]]en Primärantikörper binden zunächst an das gesuchte Protein. Nach dem Entfernen unspezifisch bindender Antikörper durch Waschen wird die Membran mit einem Sekundärantikörper behandelt. Der Sekundärantikörper bindet an die [[Fc-Region]] des Primärantikörpers und ist z.B. an ein [[Enzym]] gekoppelt, das eine Farbreaktion katalysiert. | |||
Nach dem Auftragen der Antikörper wird die Membran mehrfach gewaschen, um alle überschüssigen Antikörper zu entfernen. Die katalysierte Farbreaktion kann nun durch Zugabe eines entsprechenden Substrats gestartet werden. In den Banden, in denen das gesuchte Protein sitzt, kann die gewünschte Farbreaktion beobachtet werden. | Nach dem Auftragen der Antikörper wird die Membran mehrfach gewaschen, um alle überschüssigen Antikörper zu entfernen. Die katalysierte Farbreaktion kann nun durch Zugabe eines entsprechenden Substrats gestartet werden. In den Banden, in denen das gesuchte Protein sitzt, kann die gewünschte Farbreaktion beobachtet werden. | ||
Alternativ kann der Sekundärantikörper auch | Alternativ kann der Sekundärantikörper auch radioaktiv markiert sein, was einen Nachweis auf Photopapier erlaubt. | ||
Eine weitere Möglichkeit ist, Meerrettich-[[Peroxidase]] gekoppelte Sekundärantikörper zu verwenden, die einen Nachweis des Proteins durch Chemolumineszenz erlauben. | Eine weitere Möglichkeit ist, Meerrettich-[[Peroxidase]] gekoppelte Sekundärantikörper zu verwenden, die einen Nachweis des Proteins durch [[Chemolumineszenz]] erlauben. | ||
==Anwendung== | ==Anwendung== | ||
In der [[Medizin]] wird der Western Blot vor allem zur [[Diagnose]] von [[Infektion]]en verwendet. Hierbei werden die spezifischen Antikörper im [[Serum]] nachgewiesen. Auch andere krankheitsrelevante Proteine, wie das [[HI-Virus]], können nachgewiesen werden. Das Bandenmuster kann Aufschluss über den Infektionszeitpunkt geben ([[Borrelien]], [[EBV]]), die Virulenzfaktoren identifizieren ([[Helicobacter]]) und zwischen Erregern unterscheiden (z.B. [[Bordetella pertussis]] vs. [[Bordetella parapertussis]]). | In der [[Medizin]] wird der Western Blot vor allem zur [[Diagnose]] von [[Infektion]]en verwendet. Hierbei werden die spezifischen Antikörper im [[Serum]] nachgewiesen. Auch andere krankheitsrelevante Proteine, wie das [[HI-Virus]], können nachgewiesen werden. Das Bandenmuster kann Aufschluss über den Infektionszeitpunkt geben ([[Borrelien]], [[EBV]]), die Virulenzfaktoren identifizieren ([[Helicobacter]]) und zwischen Erregern unterscheiden (z.B. [[Bordetella pertussis]] vs. [[Bordetella parapertussis]]). | ||
Der Western Blot wird häufig als [[Bestätigungstest]] eines positiven [[ELISA]]-[[Suchtest]]s eingesetzt, z.B. bei der [[HIV]]-Diagnostik. Sofern die Beurteilung des Tests korrekt erfolgt, dürfte die [[Spezifität]] eines durch Western Blot bestätigten positiven ELISA-Ergebnisses bei nahezu 100 % liegen. | |||
[[Fachgebiet:Labormedizin]] | [[Fachgebiet:Labormedizin]] | ||
[[Tag:Antikörpernachweis]] | [[Tag:Antikörpernachweis]] | ||
Aktuelle Version vom 26. März 2024, 15:02 Uhr
Synonyme: Immunblot, Immunoblot
Englisch: immunoblot
Definition
Der Western Blot ist ein molekularbiologisches Verfahren zum Nachweis von Proteinen durch Übertragung (Blotting) auf eine Trägermembran. Durch verschiedene anschließende Reaktionen können dann bestimmte Proteine nachgewiesen werden.
Eine Weiterentwicklung des Western Blots ist der Line-Blot.
Herkunft des Namens
1975 wurde das erste Blotverfahren zum Nachweis von DNA-Fragmenten von Edwin Southern und dem Namen Southern Blot eingeführt. Daran angelehnt wurden der Nachweis von RNA als Northern Blot und der Nachweis von Proteinen als Western Blot bezeichnet.
Methode
Vor dem eigentlichen Western Blot muss das Proteingemisch aufgetrennt werden. Ein Beispiel wäre hier die SDS-PAGE, bei dem die Proteine im elektrischen Feld entsprechend ihrer Größe unterschiedlich weit auf einem Polyacrylamid-Gel wandern. Nachdem die Proteine nun 'sortiert' sind, werden sie mit Hilfe eines weiteren elektrischen Feldes, das senkrecht zu dem Gel steht, auf eine PVDF- oder Nitrocellulose-Membran übertragen.
Schematischer Aufbau eines Western Blot: Schlitten (a), Schwämme (b), dünne- (c) u. dicke- (d) Whatman-Papiere, PVDF-Membran (e), Polyacrylamid Gel (f)
Die Proteinbanden sind nun fest auf der Membran gebunden und können mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden. Am häufigsten werden hier Antikörper verwendet, die an ein bestimmtes Protein (z.B. Virusprotein) binden. Damit ein Ergebnis zustande kommt, müssen vorher die freien Bindungsstellen auf der Membran mit Proteinen, die nicht von Antikörpern erkannt werden können, blockiert werden. Dazu behandelt man die Membran z.B. mit Bovinem Serumalbumin oder einer Milchpulver-Lösung.
Anschließend werden zwei verschiedene Antikörper auf die Membran gegeben. Die spezifischen mono- oder polyklonalen Primärantikörper binden zunächst an das gesuchte Protein. Nach dem Entfernen unspezifisch bindender Antikörper durch Waschen wird die Membran mit einem Sekundärantikörper behandelt. Der Sekundärantikörper bindet an die Fc-Region des Primärantikörpers und ist z.B. an ein Enzym gekoppelt, das eine Farbreaktion katalysiert.
Nach dem Auftragen der Antikörper wird die Membran mehrfach gewaschen, um alle überschüssigen Antikörper zu entfernen. Die katalysierte Farbreaktion kann nun durch Zugabe eines entsprechenden Substrats gestartet werden. In den Banden, in denen das gesuchte Protein sitzt, kann die gewünschte Farbreaktion beobachtet werden.
Alternativ kann der Sekundärantikörper auch radioaktiv markiert sein, was einen Nachweis auf Photopapier erlaubt.
Eine weitere Möglichkeit ist, Meerrettich-Peroxidase gekoppelte Sekundärantikörper zu verwenden, die einen Nachweis des Proteins durch Chemolumineszenz erlauben.
Anwendung
In der Medizin wird der Western Blot vor allem zur Diagnose von Infektionen verwendet. Hierbei werden die spezifischen Antikörper im Serum nachgewiesen. Auch andere krankheitsrelevante Proteine, wie das HI-Virus, können nachgewiesen werden. Das Bandenmuster kann Aufschluss über den Infektionszeitpunkt geben (Borrelien, EBV), die Virulenzfaktoren identifizieren (Helicobacter) und zwischen Erregern unterscheiden (z.B. Bordetella pertussis vs. Bordetella parapertussis).
Der Western Blot wird häufig als Bestätigungstest eines positiven ELISA-Suchtests eingesetzt, z.B. bei der HIV-Diagnostik. Sofern die Beurteilung des Tests korrekt erfolgt, dürfte die Spezifität eines durch Western Blot bestätigten positiven ELISA-Ergebnisses bei nahezu 100 % liegen.