Affinitätschromatografie

Die Affinititätschromatographie kann zur Isolierung eines einzelnen Moleküls aus einer Lösung verwendet werden, wenn dieses spezifisch an einen Liganden binden kann. Die Matrix besteht in der Regel aus Agarose-Derivaten, die selbst sehr reaktionsarm sind. Durch die kovalente Bindung eines Liganden an diese Matrix wird die Spezifität erreicht. Dabei kann zusätzlich ein sogenannter Spacer eingefügt werden, der den Abstand zwischen Ligand und Matrix erhöht. Dadurch kann die Interaktion zwischen Ligand und Molekül verbessert werden.

Bei der Wahl des Liganden ist auf die Bindungskonstante K_D zu achten, die im Bereich zwischen 10^-5 M und 10^-7 M liegen sollte. Die Bindungskonstante K_D gibt dabei Aufschluss über die Affinität und Bindungsstärke zwischen Ligand und Molekül.

Bei K_D:

• > 10^-4M: Die Bindung des Moleküls an den Liganden ist zu schwach; eine effektive Reinigung ist nicht möglich.
• > 10^-8M: Die Bindung des Moleküls an den Ligand ist zu stark, so dass eine Elution nicht mehr möglich ist.

Als Alternative zur Matrix mit spezifischen Liganden können auch sog. Affinitätsgele verwendet werden.

Allgemein

Zunächst werden die Matrix und die Lösung, in dem sich das zu isolierende Molekül befindet, in einem geeigneten Puffer äqiulibriert und nach Einstellung des pH-Werts und der Ionenstärke auf eine Säule aufgetragen. Die zu isolierenden Moleküle binden nun an die Liganden an der Matrix und alle restlichen Moleküle können durch mehrmaliges Waschen mit spezieller Waschlösung entfernt werden. Zur Lösung der gebundenen Moleküle wird eine sogenannte Elution durchgeführt. Schließlich wird die Matrix wieder regeneriert.

Elution

Die Elution bei der Affinitätschromatographie beruht grundsätzlich darauf, dass die Interaktion zwischen Ligand und Molekül geschwächt wird. Dies kann erreicht werden durch:

• Zugabe von freien Liganden im Überschuss
• Starke Änderung der Ionenstärke und/oder Änderung des pH-Werts
• Zugabe von chaotropen Substanzen, wie bspw. Perchloraten, die auf Wasserstoffbrückenbindungen beruhende Interaktionen stören
• Zugabe von Harnstoff, Guanidinhydrochlorid und nicht-ionischen Detergenzien

• Schwierige Elution, da Affinität zwischen Ligand und zu isolierendem Molekül extrem hoch ist
• Oftmals nur geringe Verfügbarkeit der Affinitätsgele

Spezifische Bindung und Erkennung von:

• Enzym und Substrat bzw. Cofaktor
• Rezeptor und Hormon
• Antigen und Antikörper
• Glutathion-S-Transferase für rekombinante Proteine
• Protein A und G für Immunglobulin G