Immunhistochemie

• Direkte Färbungen: der primäre Antikörper ist mit einem Marker gekoppelt
• Indirekte Färbungen: es wird ein mit dem Marker gekoppelter sekundärer Antikörper gegen das F_C-Fragment des primären Antikörpers eingesetzt

Handelt es sich bei dem Marker um einen fluoreszierenden Farbstoff, spricht man von Immunfluoreszenz.

Das Prinzip der Nachweisreaktion kommt durch eine Affinität des eingesetzten Antikörpers zu einer speziellen Gewebeart zustande. Eine ganz bestimmte Eigenschaft des Gewebes (Epitop, immunhistochemischer Marker) löst dann eine Antigen-Antikörper-Reaktion aus. In den meisten Fällen gehen das Epitop und der sogenannte Primärantikörper dabei eine feste Bindung ein. An den Antikörper wird vor der Zugabe zu dem zu untersuchenden Präparat mittels Kopplung ein bestimmtes Nachweissystem angehängt, welches die Gegenwart und Aktivität der Antikörper anzeigen soll. Somit entspricht der Nachweis der Antikörper dem Nachweis der bestimmten gesuchten Gewebeeigenschaft – des Epitops. Überwiegend werden heute gentechnisch hergestellte monoklonale Antikörper verwendet.

Unter dem Lichtmikroskop (bzw. Fluoreszenzmikroskop) werden das Muster und die Intensität der Färbung beurteilt. Dadurch kann beispielsweise malignes Gewebe von dem umgebenden, benignen Gewebe abgegrenzt werden. Das Ziel ist, ein ausreichend starkes Färbesignal im Areal des Epitops zu erreichen, während die nicht zum Epitop gehörenden Gewebeabschnitte möglichst ungefärbt bleiben sollen. Durch Einsatz verschiedener Fluorochrome können auch mehrere Zellarten in unterschiedlichen Farben dargestellt werden.

Wenn nicht Gewebe, sondern Zellen in Lösungen typisiert werden sollen, wird häufig die Fluoreszenz-Durchflusszytometrie eingesetzt.

Indirekte Immunfluoreszenz

Ablauf

Die indirekte Immunfluoreszenz (IIF) besteht aus zwei Schritten:

• Zunächst wird ein spezifischer Primärantikörper auf das zu untersuchende Präparat (Zellen, Gewebeproben) gebracht.
• Danach erfolgt die Auftragung eines zweiten Antikörpers, der sich gegen den zuvor aufgebrachten Primärantikörper richtet. Dabei handelt es sich um einen Sekundärantikörper, an den z.B. ein Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist.

Auf diese Weise entsteht ein sichtbares Farbsignal, das nun als Indikator für das Epitop dient. Alternativ kann die Farbgebung auch als Ergebnis einer Enzym-Substrat-Reaktion auftreten, wenn statt eines Farbstoffes ein Enzym an den Sekundärantikörper gekoppelt ist.

Anwendung

Die Methode wird in der Immunhistochemie verbreitet eingesetzt, da sie vergleichsweise kostengünstig ist. Durch den zweiten Antikörper wird die Signalintensität erhöht, wodurch sich stärkere Signale auch bei kleineren Antigenmengen erreichen lassen.

Beispiel

Die indirekte Immunfluoreszenz wird zum Beispiel zum Nachweis von Antinukleären Antikörpern (ANA) eingesetzt, siehe ANA-IFT. Im Unterschied zur typischen Immunhistochemie, bei der bestimmte Strukturen in Gewebeproben von Patienten markiert werden, wird beim ANA-IFT die Spezifität des Antikörpers im Serum untersucht. Da die Zielstruktur der vom Patienten gebildete Antikörper ist, kann hier nicht mit direkter Immunfluoreszenz gearbeitet werden.

Direkte Methode

Ablauf

Das zu untersuchende Material wird direkt mit einem konjugierten Primärantikörper zusammengebracht. Auch hier dient das entstandene Farbsignal als Indikator für das zu untersuchende Epitop.

Anwendung

Diese Methode eignet sich gut zur Darstellung von mehreren verschiedenen Antigenen in einem Präparat. Wenn jedoch nur wenig Antigen in der Probe vorhanden ist, reicht das Farbsignal möglicherweise nicht aus.

Weitere Methoden

• APAAP-Methode: Einsatz eines Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Komplexes als Indikator
• Labelled (Strept-)Avidin-Biotin-Methode (LSAB): Beruht auf der Affinität von Streptavidin (Streptomyces avidinii) oder Avidin (Hühnereiweiß) für Biotin

In der onkologischen Diagnostik kommen immunhistochemische Verfahren zur Identifikation von Tumoren zum Einsatz. Anhand des Expressionsmusters der Oberflächenantigene kann das untersuchte Gewebe eindeutig dem Ursprungsgewebe zugeordnet werden, auch wenn es histologisch nicht mehr als solches zu erkennen ist. Zudem können in bestimmten Fällen auch Marker nachgewiesen werden, die in der Tumortherapie als Zielantigen (Drug Target) von bestimmten Medikamenten dienen.

• Luminol: Bildung von Chemolumineszenz
• TMB (Tetramethylbenzidin): Bildet ein tiefblaues Endprodukt
• DAB (3,3'-Diaminobenzidin): Braunes Endprodukt
• Neufuchsin: Rosa-rotes Endprodukt
• AEC (3-Amino-9-Ethylcarbazol): Rotes Endprodukt
• Naphthol-AS-MX-Phosphat: Rotes Endprodukt