TUNEL-Methode
Synonym: TUNEL-Assay
Englisch: TUNEL assay
1. Definition
Die TUNEL-Methode ist ein molekularbiologisches Verfahren, das dem Nachweis apoptotischer Zellen dient. Diese werden anhand der charakteristischen DNA-Fragmentierung mittels Fluoreszenzmikroskopie detektiert.
2. Nomenklatur
TUNEL ist ein Akronym und steht für "terminal desoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling".
3. Prinzip
Im Rahmen der Apoptose findet die Fragmentierung der DNA durch die Caspasen-aktivierte DNase statt. Diese Endonuklease spaltet die freiliegende DNA zwischen den Nukleosomen. Somit entstehen in regelmäßigen Abständen (Vielfaches von 180–200 Basenpaaren) Einzelstrangbrüche. An diesen sogenannten nicked-ends befindet sich eine freie 3'-OH-Gruppe.
An diesen Hydroxygruppen werden die Bruchstellen mittels Fluoreszenzfarbstoff- oder Enzym-konjugiertem Desoxyuridintriphosphat (dUTP) markiert. Die kovalente Bindung wird durch die terminale Desoxynucleotidyl-Transferase (TdT) katalysiert.
Ein Nachweis der Bindung von dUTP an nicked-ends ist danach z.B. mittels Fluoreszenzmikroskopie möglich. Die markierten Zellen werden als TUNEL-positiv bezeichnet.
4. Ablauf
4.1. Fixierung
Das zu untersuchende Gewebe muss zunächst fixiert werden, um die biologisch relevanten Strukturen zu erhalten. Dies geschieht durch Eintauchen des Gewebepräparats in eine Fixierlösung, wodurch die intrazellulären Proteine durch Crosslinking fixiert werden.
Das fixierte Gewebe wird anschließend in ca. 10 µm dünne Scheiben geschnitten.
4.2. Permeabilisierung
Die Permeabilisierung ermöglicht das Vordringen des TUNEL-Reagenz (bestehend aus tdT und fluoreszenzmarkierten dUTPs) in den Zellkern.
4.3. Start der TUNEL-Reaktion
Das TUNEL-Reagenz wird hinzugefügt und der Reaktionsansatz bei 37 °C für 1 bis 3 Stunden inkubiert. Die TUNEL-Reaktion benötigt Cobalt als Cofaktor, dieses befindet sich in der Pufferlösung. Der Reaktionsansatz muss vor Licht geschützt werden, damit der Fluoreszenzfarbstoff nicht ausbleicht.
4.4. Abstoppen der TUNEL-Reaktion
Nach Ablauf der TUNEL-Reaktion wird diese durch Hinzugabe eines Stopp-Puffers abgebrochen. Es folgt eine kurze Inkubation, bevor der Ansatz mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen wird.
4.5. Analyse
Die TUNEL-positiven Zellen werden unter dem Fluoreszenzmikroskop detektiert, gezählt und ihr prozentualer Anteil bestimmt. Darüber wird das Ausmaß der Apoptose im untersuchten Gewebe quantifiziert.
5. Anwendungsbeispiele
Die TUNEL-Methode findet u.a. in der Embryologie, der Infektiologie und der Onkologie Anwendung.
5.1. Embryologie
Die Apoptose ist ein wesentlicher Vorgang während der Embryogenese. Die TUNEL-Methode kann daher genutzt werden, um den Einfluss bestimmter Substanzen auf die Entwicklung des Embryos zu überprüfen, bzw. regulär ablaufende apoptotische Prozesse im Embryo aufzuzeigen.
5.2. Infektiologie
Virale Infektionen führen i.d.R. zum programmierten Zelltod, da infizierte Zellen entweder ausgelöst durch intrazelluläre Signalkaskaden einen "altruistischen Selbstmord" begehen oder Killerzellen des Immunsystems die Apoptose induzieren. Das Ausmaß des Zelluntergangs kann mittels TUNEL-Methode bestimmt werden.
5.3. Onkologie
Die Apoptoseresistenz ist eines der Hallmarks of Cancer. In präklinischen Studien wird daher z.B. untersucht, ob ein Wirkstoff bei entarteten Zellen die Apoptose induzieren kann. Die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen dient hierbei als Maß für die Wirksamkeit.
6. Nachteile
Das Verfahren markiert im untersuchten Gewebe nicht nur apoptotische Zellen sondern ebenfalls:
- nekrotische Zellen
- Zellen während der DNA-Reparatur bzw. Replikation
- mechanisch-geschädigte Zellen