Real-Time Quantitative PCR

Die Abkürzung "RT-PCR" wird auch für die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion verwendet, hierbei handelt es sich aber um eine andere Technik. Allerdings kann der Realtime-PCR eine reverse Transkription vorgeschaltet werden, z.B. um RNA-Viren zu untersuchen.

Bei älteren PCR-Methoden wie der PCR mit Sequenz-spezifischen Primern (SSP-PCR) wird die Polymerase-Kettenreaktion für eine bestimmte, vorher festgelegte Anzahl von Zyklen durchgeführt und dann festgestellt, ob das gesuchte Genprodukt vorhanden ist, d. h. amplifiziert wurde, oder nicht.

Bei der Realtime-PCR wird nach jedem Amplifikationszyklus die Menge der entstandenen DNA analysiert. Dadurch kann eine Aussage über die Kinetik der Amplifikationsreaktion gemacht werden.

Technisch gibt es zwei Verfahren, um die Menge der neu entstandenen DNA zu messen:

• Bei der unspezifischen Methode wird ein Färbemittel verwendet, das sich an alle doppelsträngige DNA (dsDNA) in der Probe anlagert, z.B. SYBR Green. Durch die Anlagerung an die DNA (Interkalierung) kommt es zur Fluoreszenz. Die Messwerte können allerdings durch Anwesenheit anderer, unspezifisch amplifizierter dsDNA-Abschnitte in der Probe verfälscht werden. Die Reaktion muss deshalb sorgfältig aufgebaut werden, um die Amplifikation so spezifisch wie möglich zu halten.
• Bei der spezifischen Methode werden so genannte "Gensonden" (engl.: probes) verwendet. Das sind kurze DNA-Abschnitte, die komplementär zu der gesuchten Sequenz sind und mit einem Fluoreszenzfarbstoff ("Reporter") sowie einem Fluoreszenzlöscher ("Quencher") markiert wurden. Durch eine Wechselwirkung zwischen Reporter und Quencher, den so genannten fluorescence resonance energy transfer (FRET), wird die Fluoreszenz unterdrückt. Die Gensonde lagert sich im Verlauf der PCR downstream des Primers an ein komplementäres Stück DNA an und wird dann durch die Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase abgebaut. Dabei wird der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt und aktiviert, da die Unterdrückung durch den Quencher entfällt. Durch Anregung der Probe mit Licht einer geeigneten Wellenläge kann dann die entstehende Fluoreszenz gemessen werden.

Ein Realtime-PCR-Gerät kombiniert einen Thermocycler mit einem Fluoreszenz-Analysator. Die Geräte verfügen in der Regel mehrere Fluoreszenzkanäle, das heißt in demselben Testansatz können bei Einsatz der spezifischen Methode mehrere Zielsequenzen parallel analysiert werden (Multiplex-PCR). Auf diese Weise lassen sich mehrere Untersuchungen ressourcenschonend in einem einzelnen Ansatz durchführen, z.B. Influenzavirus, SARS-CoV-2 und RSV. Es kann auch ein Kontrollgen mitgeführt werden, das in menschlichen Zellen exprimiert wird, um zu überprüfen, wie gut die Qualität des Probenmaterials ist. Bei der RT-PCR-Untersuchung von Erststrahlurin auf Chlamydia trachomatis kann z.B. überprüft werden, ob der Urin genügend Zellmaterial enthält, um eine valide Aussage treffen zu können.

Durch die Messung von so genannten Standards, d.h. artifiziellen Testmaterialien mit einer bekannten Menge an DNA oder RNA, kann eine Eichkurve erstellt und das PCR-Ergebnis quantifiziert werden - daher das Synonym qPCR. Hierzu werden die Threshold Cycle (C_t) der verschiedenen Proben ausgewertet. Der Threshold Cycle ist der Amplifikationzyklus, bei dem die PCR in die exponentielle Phase übergeht. Er ist proportional zur Konzentration des Zielgens im Reaktionsansatz.

Inzwischen sind stark vereinfachte Realtime-PCR-Geräte auf dem Markt, die praktisch ohne Probenvorbereitung auskommen und dadurch sogar in der patientennahen Sofortdiagnostik eingesetzt werden können.