Single-molecule real-time sequencing

• sehr große Read-Länge (bis zu 15.000 bp)
• kein Amplifikationsschritt
• sehr kurze Laufzeiten
• geringerer Durchsatz
• hohe Fehlerrate

Die SMRT-Technologie erlaubt die Sequenzierung und Detektion eines einzelnen DNA-Moleküls. Ermöglicht wird dies durch spezifische Reaktionskammern in Nanometergröße. Diese werden als Zeromode Waveguide (ZMW) bezeichnet. Am Boden dieser Kammern befindet sich nur ein einziges DNA-Molekül, dass mit einer Polymerase verbunden ist. Es werden die vier verschiedenen dNTPs, die mit jeweils einem anderen fluoreszierenden Label verbunden sind, in die Reaktionskammern gegeben. Sobald eines dieser Nukleotide an die Polymerase bindet und eingebaut wird, kann es gemessen werden.

Die Kerneigenschaft wird durch die ZMW-Reaktionskammer ermöglicht. Sie ist ein langer Zylinder und durch die winzigen Abmessungen ist ein anderes Verhalten des zur Anregung verwendeten Lichts zu beobachten. Statt durch die Reaktionskammer durchzugehen, wird nur eine kleine Schicht am Boden erleuchtet, genau dort, wo sich die Polymerase befindet. Alle Nukleotide die gerade nicht gebunden sind, werden nicht angeregt. Dies findet parallel in tausenden Reaktionskammern gleichzeitig statt.

Der entscheidende Vorteil von langen Reads ist es, schwierige Regionen zu sequenzieren. Enthält beispielsweise eine Region eine repetitive Sequenz, die hundert oder tausendfach wiederholt wird, dann ist es unmöglich diese mit Methoden zu sequenzieren, die nur 100-250 bp Reads produzieren. SMRT kann hier problemlos diese Regionen inklusive angrenzender Bereiche sequenzieren.

Probenaufbereitung

Die Probe wird so fragmentiert, dass DNA-Stücke mit einer Länge von 1.000-60.000 bp entstehen.

Adapter

An die doppelsträngige DNA werden haarnadelförmige Adapter an beide Enden ligiert, so dass eine kreisförmig abgeschlossen DNA entsteht.

Sequenzierung

Die DNA mit den Adaptern wird in die ZMW-Reaktionskammer gegeben. Am Boden dieser Kammer befindet sich eine immobilisierte Polymerase. Es werden die vier dNTPs zugegeben und die Polymerase beginnt einen komplementären Strang zu synthetisieren. Sobald ein Nukleotid an das katalytische Zentrum bindet, wird es gemessen.

Das fluoreszente Label befindet sich nicht an der Nukleobase, sondern am Phosphat. Dies bedeutet, dass durch Abspaltung des Pyrophosphats auch das Label automatisch abgetrennt wird und die nächste Messung nicht beeinträchtigt.

Wenn das DNA-Fragment einmal komplett sequenziert wurde und die Polymerase stabil ist, dann wird sie auch den Adapter sequenzieren. Da dieser haarnadelförmig auch an den komplementären Strang gebunden ist, geht sie dann ebenfalls auf diesen Strang über und sequenziert diesen. So können mehrere Runden derselben DNA sequenziert werden.

Detektion

Da die Reaktion unsynchronisiert gleichzeitig in vielen Reaktionskammern stattfindet, nimmt die verwendete Kamera nicht Einzelbilder auf, sondern einen kontinuierlichen Film.

Methoden wie die 454-Sequenzierung oder Illumina-Sequenzierung wurden als Next Generation Sequencing bezeichnet, da sie anders als die klassische Sanger-Sequenzierung erstmals eine vollautomatisierte, kostengünstige Sequenzierung von Millionen Basenpaaren ermöglichten. Mittlerweile wurden aber neue Methoden, wie die hier beschrieben SMRT-Technologie oder die Nanopore-Sequenzierung entwickelt, welche wiederum als eine weitere Generation betrachtet werden. Deswegen werden in der Literatur die NGS-Methoden als Second Generation Sequencing und die Single-Molecule Ansätze als Third Generation Sequencing bezeichnet.

• Rhoads, A. & Au, K. F. PacBio Sequencing and Its Applications. Genomics Proteomics Bioinformatics 13, 278-289, doi:10.1016/j.gpb.2015.08.002 (2015).
• Quail, M. A. et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics 13, 341, doi:10.1186/1471-2164-13-341 (2012).
• Ardui S, Ameur A, Vermeesch JR, Hestand MS. Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medical diagnostics. Nucleic Acids Research. 2018;46(5):2159-2168. doi:10.1093/nar/gky066.