Cre/loxP-System

Tiermodelle, insbesondere Knockout-Mäuse, bilden eine wichtige Säule medizinischer Forschung. Da das komplette Fehlen einiger Gene zum Tod des Embryos bereits vor der Geburt führt, ist es notwendig, den Knockout erst zu einem späteren Entwicklungszeitpunkt stattfinden zu lassen. Viele Tiermodelle erfordern außerdem gewebespezifische Knockouts, um die Situation im Menschen besser darzustellen.

Der Mechanismus der Rekombination entspricht dem der Tyrosinrekombinasen und wird im Artikel Ortsspezifische Rekombination detaillierter behandelt.^[2]

Übersicht:

• Ein Gen wird mit Erkennungssequenzen (loxP-sites) der Cre-Rekombinase markiert.
• Die Expression der Cre-Rekombinase kann durch entsprechende Promotor reguliert werden
• Nach Aktivierung der Cre-Rekombinase wird die Sequenz zwischen den loxP-Sites durch Rekombination entfernt.

Soll beispielsweise die Rolle des Tumorsuppressors BRCA1 bei Brustkrebs an einem Mausmodell genauer untersucht werden, werden die essentiellen Exons dieses Gens mit loxP-Erkennungssequenzen flankiert. Theoretisch könnte auch das gesamte Gen deletiert werden, in der Praxis wird das Cre/loxP-System aber ineffizienter, je weiter die loxP-Sites voneinander entfernt sind.^[3] Bei BRCA1 wird oftmals das Exon 11 mit Erkennungssequenzen umgeben (umgangssprachlich "gefloxt").^[4] Diese Sequenzen werden meist in den Intronbereichen des Gens platziert.

Das durch die Deletion verkürzte Protein ist nicht mehr funktionsfähig. Oftmals werden diese verkürzten Proteine durch zelluläre Qualitätskontrollmechanismen sofort abgebaut. Diese Allelvarianten werden analog wie bei der Erzeugung von Knockout-Mäusen in ES-Zellen durch Vektoren eingebracht. Die Cre-Rekombinase wird meist durch eine zweite Mauslinie mittels Verpaarung bereitgestellt. Durch Kombination mit dem WAP-Promotor, einem Gen, welches fast ausschließlich in den Epithelialzellen der Milchdrüsen hergestellt wird, findet eine Aktivierung der Rekombinase nur im Brustgewebe statt. Je nach Fragestellung müssen beide Mausstämme so gekreuzt werden, dass nur ein oder beide Allele gefloxt sind.

• Induzierbarer Promotor: Der Cre-Promotor kann auch mit der Ligandenbindungsdomäne des Estrogenrezeptors fusioniert werden. Durch Gabe von Tamoxifen kann die Expression nun zu jedem beliebigen Zeitpunkt stattfinden.^[5]
• Genaktivierung I: Neben dem Ausschalten von Genen kann das Cre/loxP-System auch zur Aktivierung von Genen verwendet werden. Dabei wird beispielsweise eine blockierende Sequenz zwischen Promotor und Genplatziert, welche selber von loxP-site flankiert ist. Nach Aktivierung der Rekombinase wird diese Sequenz entfernt und das Gen kann exprimiert werden.
• Genaktivierung II: Das zu aktivierende Gen liegt invertiert vor. Sind die flankierenden loxP-sites in gegensätzlicher Orientierung, wird der Abschnitt nach Aktivierung der Rekombinase nicht deletiert, sonder wird nun in die korrekte, funktionale Ausrichtung invertiert.