CRISPR-System
Definition
Hintergrund
CRISPR ist ein Akronym und steht für "clustered regularly interspaced short palindromic repeats".
Das bakterielle System ist die Grundlage für das CRISPR/Cas-System, das in der Molekularbiologie bzw. Biotechnologie als gentechnische Methode verwendet wird, um DNA-Sequenzen gezielt zu verändern.
Der Begriff CRISPR wird häufig synonym für sowohl das CRISPR/Cas-System als auch für das bakterielle CRISPR-System verwendet. Im engeren Sinne ist damit aber nur ein spezifischer Abschnitt im CRISPR-Locus gemeint.
Prinzip
Das CRISPR-System funktioniert als eine Art adaptives Immunsystem für Bakterien. Das Prinzip beruht darauf, dass fremde DNA erkannt und Abschnitte davon in einem spezifischen Bereich in der eigenen, bakteriellen DNA (CRISPR-Locus) eingebaut werden. Aus diesem Locus werden kleine RNAs, sogenannte crRNAs transkribiert. Diese lotsen anschließend Nukleasen spezifisch zu Abschnitten in der fremden DNA, wodurch ein Abbau induziert wird.
Da die Fremd-DNA fest in das Genom der Bakterien integriert wird, entwickelt sich auf Dauer eine Resistenz gegenüber einzelne Phagen.
CRISPR-Locus
Viele Bakterien besitzen einen oder mehrere CRISPR-Loci, die immer nach dem gleichen Prinzip aufgebaut sind. Namensgebend sind kurze wiederholende Einheiten, die "Repeats" genannt werden. Innerhalb eines Locus sind diese identisch in ihrer Sequenz und Länge, zwischen verschiedenen Spezies variieren sie und habe eine Länge zwischen 21 und 72 Basenpaaren. Viele Repeats besitzen palindromische Abschnitte und neigen dazu, Haarnadelstrukturen auszubilden. Zwischen zwei Repeats liegt ein sogenannter "Spacer", der fremde DNA enthält. Der Mechanismus, über den diese Abschnitte, auch "Protospacer" genannt, aus der fremden DNA ausgeschnitten und in den CRISPR-Locus eingebaut werden, ist nicht vollständig verstanden. Bekannt ist, dass die Protospacer an beiden Enden sogenannte "Protospacer adjacent motifs" (PAMs) enthalten, über welche die Fremd-DNA vermutlich erkannt wird. Die PAMs werden allerdings nicht mit ausgeschnitten und sind später nicht Teil des Spacers im CRISPR-Locus. Die Anzahl von Repeat-Spacer-Einheiten pro Locus varriert stark. Vor diesen Einheiten liegt eine sogenannte Leader-Region, die unter anderem einen Promotor für die Transkription enthält. Upstream vom Leader liegt die Sequenz verschiedenener sogenannter "CRISPR-associated genes", kurz Cas-Gene. Diese codieren für verschiedene Proteine, die vermutlich an der Funktionalität des CRISPR-Systems beteiligt sind.
Mittlerweile sind eine Vielzahl von CRISPR-Loci beschrieben, die bestimmten Spezies zugeordnet sind. Das bekannteste CRISPR-System ist der Typ II, der die Gene CAS9, CAS1, CAS2 und entweder CNS2 oder CAS4 besitzt. Von diesem System, das u.a. in Streptococcus pyogenes vorkommt, leitet sich das CRISPR/Cas-System ab.
crRNA-Synthese
Der gesamte Abschnitt aus Repeats und Spacern wird als ein pre-crRNA-Vorläufer transkribiert und anschließend über Endoribonukleasen zu reifen crRNAs zerschnitten. Diese assemblieren zu Ribonukleoprotein, die Nuklease-Aktivität besitzen. Je nach CRISPR-Locus unterscheiden sich die Mechanismen der crRNA-Synthese.
Im Fall vom erwähnten Typ II werden zusätzlich zu den crRNAs sogenannte "trans-activating CRISPR RNAs" (tracrRNAs) gebildet. Diese sind komplementär zu der Repeat-Sequenz und hybridisieren so mit der pre-crRNA, was die Voraussetzung für die enzymatische Spaltung des Vorläufers ist.
Abbau der Fremd-DNA
Die fertigen Ribonukleoproteine besitzen also crRNAs, die komplementär zu bestimmten Bereichen der Fremd-DNA sind. Nach dem Prinzip der RNA-DNA-Hybridisierung erkennen die Ribonukleoproteine die entsprechenden Sequenzen und binden an diese. Die enthaltene Nuklease, im Fall von Typ II Cas9, zerschneidet anschließend die DNA und verhindert so, dass eine Vermehrung sattfinden kann.
Quellen
- Chylinski et al. The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems. RNA Biol, 2013
- Karginoc et al. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell; 2010
- Sander et al. CRISPR-Cas systems for genome editing, regulation and targeting. Nat Biotechnol; 2014
- Sorek et al. CRISPR-mediated adaptive immune systems in bacteria and archaea. Annu Rev Biochem; 2013