Patch-Clamp-Technik

Vom Verfahren her existieren unterschiedliche Varianten der Patch-Clamp-Technik. Das wichtigste Unterscheidungskriterium ist dabei, ob das zu untersuchende Fragment der Zellmembran aus der Zelle herausgeschnitten wird, oder ob die Messung an der Gesamtheit der funktionellen Zelle durchgeführt wird.

Die Technik existiert in dieser Form seit dem Jahr 1976 und wurde von den beiden Wissenschaftlern Bert Sakmann und Erwin Neher - gemeinsam mit Kollegen vom Max-Planck-Institut Göttingen - entwickelt und beschrieben. Beide erhielten als Ehrung für diese Leistung 1991 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin.

Grundlage der Patch-Clamp-Technik ist zunächst die biologische Tatsache, dass eine Zelle mit zahlreichen Ionenkanälen und Poren ausgestattet ist. Je nach physiologischem Zustand der Zelle befinden sich innerhalb und außerhalb der Zelle vollkommen unterschiedliche Ionenkonzentrationen bzw. Ladungen. Obwohl die Lipiddoppelschicht der Membran für Ionen und Wassermoleküle undurchlässig ist, kommt es regelmäßig zu einem Austausch von geladenen Teilchen durch die Zellmembran. Dies ist durch die Spannungsabhängigkeit der Ionenkanäle zu erklären.

Ist ein bestimmtes Membranpotenzial erreicht, öffnen sich die Kanäle nach dem Alles-oder-nichts-Prinzip. Die Patch-Clamp-Technik setzt exakt dort an: Eine extrem feine Messpipette mit einem Durchmesser von etwa 1 μm wird zu einem Ionenkanal vorgeschoben, ohne die Zellmembran dabei zu perforieren. Dies erlaubt eine räumlich exakte Bestimmung des lokalen elektrischen Potenzials. Durch eine elektrisch sehr enge Verbindung zwischen der Zellmembran und dem Rand der Pipette werden (das Ergebnis verfälschende) Leckströme weitestgehend vermieden.

Es gibt grundsätzlich zwei unterschiedliche Messverfahren, die Current-Clamp-Technik und alternativ die Voltage-Clamp-Technik.

Darüber hinaus wurden auf der Basis der ursprünglichen Patch-Clamp-Technik zahlreiche Varianten entwickelt. Ein Beispiel ist der Makropatch, auch Giant-Patch-Technik genannt. Bei diesem Verfahren wird statt der Messpipette ein Membranpatch mit einem Durchmesser von 10 bis 40 μm verwendet. Den Makropatch kann man nochmals in einen Outside-out-Makropatch und einen Inside-out-Makropatch differenzieren.

Weiterhin existieren spezielle Patch-Methoden wie die Perforated-Patch-Clamp-Technik oder Kombinationen der Patch-Clamp-Technik mit molekularbiologischen Nachweismethoden wie der RT-PCR.^[1]

• enzymatische Entfernung von Bindegewebsresten
• Entfernung der Zellwand bei Pflanzenzellen Zugabe von Cellulasen, die die Wand verdauen

• inverses Mikroskop oder aufrechtes Mikroskop
• Probenhalter (mit zugehöriger Badelektrode)
• Messtisch (schwingungsgedämpft)
• Mikromanipulator

• Anfertigung aus einer sehr feinen Glaskapillare
• Befüllung der Pipette mit einer Strom-leitfähigen Lösung
• in die Lösung wird ein sehr feiner Silberdraht getaucht, der eine Beschichtung aus Silberchlorid enthält
• im Anschluss wird die Pipette in die Messapparatur eingespannt und mit einem Vorverstärker gekoppelt
• durch einen vorgeschalteten Operationsverstärker genügt eine Pipette, die in Kontakt mit der Zelle tritt