Schmelzkurvenanalyse

Wird die DNA-Doppelhelix starker Hitze ausgesetzt, werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren voneinander getrennt und es entstehen zwei DNA-Einzelstränge. Die benötigte Temperatur ist abhängig vom jeweiligen Anteil der Guanin/Cytosin- und Adenin/Thymin-Paare sowie von der Basenabfolge und der Fragmentlänge. Somit hat jedes DNA-Fragment eine charakteristische Schmelztemperatur.

Der Vorgang der Dissoziation kann unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 260 nm beobachtet werden, weil Doppel- und Einzelstrang-DNA unterschiedliche Absorptionskoeffizienten aufweisen. Alternativ kommen Fluoreszenzfarbstoffe wie SYBR Green I zum Einsatz. Durch kontinuierliche Messung der Absorption bzw. der Abnahme der Fluoreszenz während des Erhitzens entsteht schließlich die Schmelzkurve.

Die Schmelzkurve hat typischerweise einen sigmoidalen Verlauf, wobei der Wendepunkt der Kurve dem Schmelzpunkt entspricht. Dieser repräsentiert den Zustand, in dem 50 % der DNA einzelsträngig und 50 % doppelsträngig vorliegt.

1. Vorbereitung der DNA-Proben
2. Durchführung der Realtime-PCR
3. Erhitzen der PCR-Produkte (normalerweise 0,2 °C/s)
4. Messung der Absorption bzw. Fluoreszenz; Aufzeichnung der Schmelzkurve
5. Analyse

Nutzt man die Schmelzkurvenanalyse zur Detektion von Mutationen, so ist der Schmelzpunkt der Mutation zu dem des Wildtyps verschoben, wobei der Unterschied des Schmelzpunktes von heterozygoten Mutationen niedriger ist als der von homozygoten Varianten.

• Arnemann, J. (2019). Schmelzkurvenanalyse. In: Gressner, A.M., Arndt, T. (eds) Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik. Springer Reference Medizin. Springer, Berlin, Heidelberg.
• Handt MJA; Identifizierung von Mutationen im FMR1-Gen mittels Schmelzkurvenanalyse (High-Resolution-Melting) und DNA-Sequenzierung; Publikationsbasierte Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum; 2016