Cas9

Cas9 setzt sich aus zwei Lappen zusammen, zwischen denen die Guide-RNA (gRNA) eingefädelt ist:

• REC-Lappen ("recognition lobe"): Er bildet den globulären und größeren Teil des Enzyms. Er umfasst eine Brückenhelix und die beiden Domänen REC1 und REC2. Gemeinsam fungieren sie als DNA-Bindestelle, die das Enzym im gewünschten Bereich fixiert.
• NUC-Lappen ("nuclease lobe"): Er vermittelt eine doppelte Endonukleasen-Funktion und setzt sich aus 3 Domänen zusammen:
  • PAM-interagierende Domäne: Sie erkennt das Protospacer Adjacent Motif (PAM-Triplett) der Fremd-DNA und initiiert dadurch die Enzymwirkung.
  • HNH-Domäne. Sie spaltet den zur gRNA komplementären Zielstrang der DNA.
  • RuvC-Domäne: Sie schneidet den gegenüberliegenden, d.h. zum Zielstrang komplementären Strang. Gemeinsam führen beide Nukleaseaktivitäten den "glatten" Doppelstrangbruch ein.

Das bisher kleinste Cas9-Gen wurde aus dem Bakterium Staphylococcus aureus isoliert und umfasst 3.159 bp.

Cas9

Die Cas-Proteinfamilie kann in drei Typen eingeteilt werden:

• Typ I, II und IIIa binden und schneiden doppelsträngige DNA
• Typ IIIb bindet und schneidet einzelsträngige RNA

Cas9 ist das Leitmolekül des Typ II.

Für Bakterien bildet die Cas9 ein natürliches Abwehrsystem, welches z.B. beim Befall durch einen Bakteriophagen zum Einsatz kommt. Die virenähnliche Fremd-DNA wird dabei zerstört und der Phage kann sich nicht weiter vermehren.

Da die DNA des Bakteriums selbst keine PAM-Tripletts besitzt, ist sie vor einer Selbstzerstörung geschützt. Allerdings haben sich einige Bakteriophagen an diesen Abwehrmechanismus angepasst und bilden Anti-CRISPR-Proteine wie AcrF1 oder AcrF2, um den Prozess zu unterlaufen.

In der Biotechnik bildet die Cas9 den enzymatischen Teil des CRISPR/Cas-Systems. Damit die Cas9 aktiv werden kann, benötigt sie

• ein PAM-Triplett
• eine spezifische gRNA, in deren unmittelbarer Nähe die DNA-Sequenz geschnitten wird.

Die bakterielle gRNA besteht immer aus einem dimeren RNA-Komplex, der durch die Zusammenlagerung von crRNA und tracrRNA entsteht.

Im Rahmen der Gentechnologie kann auch eine künstliche Variation hergestellt werden, die dann als sgRNA (engl. single guided RNA] bezeichnet wird. Die sgRNA vereint beide Funktionen der crRNA und tracrRNA in nur einem Strang und imitiert dadurch die natürliche Wirkung der Sekundärstruktur. Da die Synthese des RNA-Komplexes entfällt, wirkt die sgRNA schneller, stellt jedoch auch eine deutlich aufwendigere und v. a. kostenintensivere Methode der Genom-Editierung dar.

• Yadav SK, Kumar V, Singh SP. Recent Trends and Techniques in Plant Metabolic Engineering, Springer, 2018

• saCas9 CC by Frankensteinper Model ID 3DPX-011815