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Polymerase-Kettenreaktion

Abkürzung für: Polymerase Chain Reaction
Synonym: Polymerase-Kettenreaktion

1 Definition

Die Polymerase-Kettenreaktion bzw. PCR ist ein enzymabhängiges Verfahren zur Vervielfältigung bestimmter Gen-Sequenzen innerhalb einer vorliegenden DNA-Kette. Sie kommt unter physiologischen Bedingungen bei der Replikation in allen Zellen vor und kann auch gentechnisch für die In vitro-Amplifizierung von Gensequenzen verwendet werden.

2 Verfahren

Das Verfahren der PCR benötigt eine einzel- oder doppelsträngige DNA-Kette mit zumindest teilweise bekannter Sequenz. Zur Durchführung der Amplifikation sind außerdem zwei Primer-RNAs essentiell, die auf beiden Seiten der Sequenz jeweils an eine der Ketten binden können sowie einzelne Nukleosidtriphosphat-Moleküle und eine hitzestabile Polymerase, die üblicherweise aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) isoliert wird.

Die PCR wird heute üblicherweise apparativ in einem Thermocycler durchgeführt. Sie läuft in mehreren Schritten ab:

2.1 Denaturierung

Durch Erwärmung des Versuchs-Assays auf bis zu 96°C wird die DNA denaturiert, indem die Wasserstoffbrücken zwischen den beiden Ketten der zu vervielfältigenden DNA gespalten werden. Die Nukleinsäure liegt danach einzelsträngig vor.

2.2 Primer-Bindung

Beim Annealing bzw. der Primerhybridisierung wird der Versuchsansatz auf ungefähr 55 bis 65°C abgekühlt und die Primer binden jeweils an das 3'-Ende der Gensequenz.

2.3 Polymerase-Bindung und DNA-Synthese

Während der Elongation synthetisiert die Polymerase bei einer Temperatur von ca. 72°C vom Primer aus in 5'-3'-Richtung den komplementären Strang. Beim ersten Durchgang entstehen Ketten variabler Länge, da die Polymerase nach der Replikation einer zufälligen Anzahl von Basenpaaren die Synthese abbricht.

2.4 Erneute Denaturierung

Die neu synthetisierten Ketten werden wieder bei 96°C geschmolzen und ermöglichen eine wiederholte Anlagerung von Primern.

2.5 Erneute DNA-Synthese

An alle einzelsträngigen DNA-Moleküle kann die Polymerase erneut ansetzen und Doppelstränge synthetisieren. Dabei entstehen nur an der ursprünglichen DNA wieder Fragmente zufälliger Länge, während bei den synthetisierten Nukleinsäuren die Polymerisation des Gegenstranges am Beginn des ursprünglichen Primers endet.

2.6 Repetition des Vorgangs

Der Ablauf von Schmelzen, Primer-Bindung und Synthese kann so lange wiederholt werden, bis die benötigte DNA-Menge hergestellt ist. Dabei entstehen in exponentieller Menge DNA-Fragmente einer bestimmten Länge, die für weitere gentechnische Experimente verwendet werden können.

3 Anwendungen

Die Anwendungen der PCR sind vielfältig: Sie wird gerichtsmedizinisch bei der Vaterschaftsdiagnostik oder bei der Analyse von am Tatort gewonnenen genetischen Materials (Genetischer Fingerabdruck) ebenso verwendet wie bei der genetischen Diagnose von Erbkrankheiten aus Blutproben oder Chorionzottenbiopsie-Material.

Die für die gentechnische Herstellung von Proteinen benötigte DNA wird heute durch PCR hergestellt.

Daneben lassen sich Bakterien oder Pilze je nach ihrem genetischen Material mit Hilfe von PCR-Reaktionen charakterisieren. Stämme von RNA-Viren lassen sich mit einem abgewandeltem Verfahren, der Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion nachweisen.

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Fachgebiete: Diagnostik, Labormedizin

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