Cas9: Unterschied zwischen den Versionen

Cas9 ist eine bakterielle Endonuklease, die DNA-Stränge mit einem Doppelstrangbruch spaltet. Das Protein dient Bakterien zur Abwehr von Bakteriophagen.

Cas9 setzt sich aus zwei Lappen zusammen, zwischen denen die Guide-RNA (gRNA) eingefädelt ist:

• REC-Lappen ("recognition lobe"): Er bildet den globulären und größeren Teil des Enzyms. Er umfasst eine Brückenhelix und die beiden Domänen REC1 und REC2. Gemeinsam fungieren sie als DNA-Bindestelle, die das Enzym im gewünschten Bereich fixiert.
• NUC-Lappen ("nuclease lobe"): Er vermittelt eine doppelte Endonukleasen-Funktion und setzt sich aus 3 Domänen zusammen:
  • PAM-interagierende Domäne: Sie erkennt das Protospacer Adjacent Motif (PAM-Triplett) der Fremd-DNA und initiiert dadurch die Enzymwirkung.
  • HNH-Domäne. Sie spaltet den zur gRNA bzw. crRNA komplementären Zielstrang der DNA.
  • RuvC-Domäne: Sie schneidet den gegenüberliegenden (zum Zielstrang komplementären) Strang. Gemeinsam führen beide Nukleaseaktivitäten den "glatten" Doppelstrangbruch ein.

Das bisher kleinste Cas9-Gen wurde aus dem Bakterium Staphylococcus aureus isoliert und umfasst 3.159 bp.

Cas9

Cas9 ist Teil der Cas-Proteinfamilie. Sie kann in drei Typen eingeteilt werden.

• Typ I, II und IIIa binden und schneiden doppelsträngige DNA
• Typ IIIb bindet und schneidet einzelsträngige RNA

Für Bakterien bildet die Cas9 ein natürliches Abwehrsystem, welches z.B. beim Befall durch einen Bakteriophagen zum Einsatz kommt. Die virenähnliche Fremd-DNA wird dabei zerstört und der Phage kann sich nicht weiter vermehren.

Da die DNA des Bakteriums selbst keine PAM-Tripletts besitzt, ist sie vor einer Selbstzerstörung geschützt. Allerdings haben sich einige Bakteriophagen an diesen Abwehrmechanismus angepasst und bilden Anti-CRISPR-Proteine wie AcrF1 oder AcrF2.

In der Biotechnik bildet die Cas9 den enzymatischen Teil des CRISPR/Cas-Systems. Damit die Cas9 aktiv werden kann, benötigt sie

• ein PAM-Triplett
• eine spezifische gRNA, in deren unmittelbarer Nähe die DNA-Sequenz geschnitten wird.

Die bakterielle gRNA (engl. to guide - leiten) besteht immer aus einem dimeren RNA-Komplex, der durch die Zusammenlagerung von crRNA und tracrRNA entsteht.

Im Rahmen der Gentechnologie kann auch eine künstliche Variation hergestellt werden, die dann als sgRNA (engl. single guided RNA] bezeichnet wird.
Die sgRNA vereint beide Funktionen der crRNA und tracrRNA in nur einem Strang und imitiert dadurch die natürliche Wirkung der Sekundärstruktur. Da die Synthese des RNA-Komplexes entfällt, wirkt die sgRNA schneller, stellt jedoch auch eine deutlich aufwendigere und v. a. kostenintensivere Methode der Genom-Editierung dar.

• Yadav SK, Kumar V, Singh SP. Recent Trends and Techniques in Plant Metabolic Engineering, Springer, 2018

• saCas9 CC by Frankensteinper Model ID 3DPX-011815