Optisch-enzymatischer Test

Um die Aktivität eines Enzyms zu messen, müssen alle an der Reaktion beteiligten Stoffe im Überschuss vorliegen, die Messung im pH-Optimum erfolgen sowie auf eine standardisierte Temperatur geachtet werden.

Man unterscheidet den einfachen optisch-enzymatischen Test und den zusammengesetzten optisch-enzymatischen Test.

Einfach optisch-enzymatischer Test

Die Aktivität von Enzymen, die NAD⁺ oder NADP⁺ als Cofaktor benötigen, wird mittels des einfach optisch-enzymatischen Tests gemessen. Grundlage ist dabei die Änderung des Absorptionsmaximums des Cofaktors. In der reduzierten Form als NADH bzw. NADPH hat es zwei Absorptionsmaxima bei 340 und 260 nm; kommt es zur Oxidation, besteht lediglich ein Absorptionsmaximum bei 260 nm. Diese Änderung wird mittels eines Photometers gemessen und anschließend mittels des Lambert-Beer'schen Gesetzes die Konzentration des Substrates berechnet, die in einer bestimmten Zeit umgesetzt wurde.

Gekoppelter optisch-enzymatischer Test

Dieser zusammengesetzte Test wird bei Reaktionen angewendet, die NAD⁺ bzw. NADP⁺ nicht als Cofaktor benötigen. Man versucht, eine Reaktion der eigentlichen Reaktion nachzuschalten, um so indirekt die Aktivität des Enzyms zu messen.

Dies wird beispielsweise zur Bestimmung der Blutzuckerkonzentration angewendet. Die Glucosekonzentration kann aus der Absorptionszunahme bei 340 nm bestimmt werden, wenn die unbekannte Glucosekonzentration in der Gegenwart eines Überschusses an ATP und NADP⁺ mit den Enzymen Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase inkubiert wird. Das Enzym Hexokinase setzt Glucose in einem ersten Schritt ATP-abhängig zu Glucose-6-phosphat um, welches in einem zweiten (gekoppelten) Schritt durch die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu 6-Phosphogluconolacton oxidiert wird. Dabei wird NADP⁺ als Cofaktor der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu NADPH reduziert. Misst man die Extinktion (340 nm), lässt sich die Konzentration des reduzierten Coenzyms NADPH mit Hilfe des Lambert-Beer'schen Gesetzes bestimmen. Die Konzentration an NADPH gilt als Maß für die Ausgangsglucosekonzentration.