Zellisolation

Ausgangspunkt einer jeden Isolation sind folgende Fragestellungen:

1. Mit welchem Zelltyp soll gearbeitet werden?
2. Was ist der Ausgangsorganismus (Zuchtlinie)?
3. Was ist das Ausgangsgewebe?
4. Welche Methoden kommen zum Einsatz?

Ausgangssituation

1. ADSC
2. Tissue Engeneering, Differenzierung
3. Ratte, Wistar-Zuchtlinie
4. Nebenhodenfettgewebe
5. Waschung, Collagenaseverdau

Vorbereitung

• Skalpell, OP-Schere, 2 Pinzetten werden hitzesterilisiert bereitgelegt
• Ratten werden mit Kohlenstoffdioxid erstickt oder durch einen Genickbruch durch eine fachkundige Person getötet
• Die Ratten werden in Isopropanol getränkt.
• Medienherstellung: Proliferationsmedium, Waschungsmedium, Collagenase Typ I - Lösung, alle anschließend im Kühlschrank gelagert.
• Zellkulturflaschen werde mit 25 ml Proliferationsmedium vorinkubiert

Tierversuch

• Bank desinfizieren und mit OP-Tuch auslegen
• Instrumente in Glas mit Isopropanol und Petrischalen in Bank für die Gewebsaufnahme
• Ratten mit der ventralen Seite nach oben unter der Laminar Flow auf dem OP-Tuch platzieren und einen medianen Schnitt setzen
• Haut großflächiger von der Faszie lösen und nach hinten Klappen
• Paramedianer inguinaler Schnitt: Fettgewebe drängt nach außen vor
• Blutungen vermeiden
• Nebenhodenfettgewebe entfernen und in Petrischale geben
• Pro Ratte: 2 x Nebenhodenfettgewebe

Aufreinigung/ Isolation:

• Gewebe wird mit einer Rasierklinge in den Petrischalen zerhackt
• Waschung mit PBS und Zentrifugation
• Abnahme des Gewebes in separate Tubes und Absaugen des Überstandes
• Erneut Waschung und Zentrifugation
• Gewebe in Tubes überführen, Rest verwerfen
• Gewebe mit Collagenase bedecken und 30 min inkubieren: Verdau
• Zugabe von Waschungsmedium zu Inaktivierung des Enzyms
• Zentrifugation, Überstand samt Gewebereste absaugen
• Zellpellet wird resuspendiert
• Zellzahlmessung und Aufteilung in gewünschte Menge in die Zellkulturflaschen
• Proliferation