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Single Base Extension

1 Definition

Unter der Single Base Extension (SBE) versteht man eine ganz bestimmte Reaktion aus dem Bereich der Biochemie, die als zentrales Ziel die Genotypisierung von Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) dient. Damit geht einer Single Base Extension (SBE) meistens eine Polymerasekettenreaktion (PCR) voraus.

2 Prinzip

  • nach einer Polymerasekettenreaktion liegt amplifizierte DNA der zu untersuchenden Region des Genoms vor. Dabei bezeichnet man die Unterschiede in den Genome von verschiedenen Personen als Polymorphismen.
  • es existieren Gen-Polymorphismen, von denen lediglich eine einzige Base betroffen ist. Diese werden als Einzel-Basen-Mutationen bzw. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) bezeichnet.
  • schon eine einzige unterschiedliche Base kann zu einer veränderten Genexpression und damit zu vollkommen anderen Genprodukten führen. Des Weiteren können verschiedene Basen zur Ausprägung von speziellen Erkrankungen führen, oder andersherum vor speziellen Krankheiten schützen.
  • die Singe Base Extension (SBE) dient nun dazu, die jeweilige bei der Person vorliegende Base zu identifizieren. Es erfolgt also eine genaue Analyse und Bestimmung des Genotyps der Person
  • entstandene PCR-Produkte werden zur Analyse mit einem SBE-Primer versetzt
  • die Gesamtreaktion der SBE ist nun exakt so konzipiert, dass der SBE-Primer um lediglich eine Base verlängert wird, wobei diese Base komplementär zu der zu untersuchenden Base des SNP ist.
  • möglich wird dies durch den Zusatz des Reaktionsansatzes ddNTPs (Didesoxynukleosidtriphosphate) statt dNTPs wie bei der PCR. Durch die fehlende OH-Gruppe am 3'-Ende kann der gewünschten komplementären Base kann keine weitere angelagert werden und es kommt zum Kettenabbruch
  • anschließend erfolgt eine Messung mittels Massenspektrometer. Dadurch kann festgestellt werden, um welche Base der SBE-Primer verlängert wurde.
  • die dieser Base entsprechende komplementäre Base entspricht dann der gesuchten SNP-Base

3 Aufbau des SBE-Primers

  • besteht aus einem Biotin-Rest, einer Photo-Spaltstelle und der SBE-Primersequenz
  • die Primersequenz ist so konstruiert, dass sie sich an ein bestimmtes Stück DNA anlagert und genau eine Basenlänge vor dem SNP endet
  • die Photospaltstelle ist besonders UV-empfindlich

4 Durchführung

  • Herstellung eines Reaktionsgemisches aus SEB-Primer, ddNTPs, Magnesiumchlorid, einer Polymerase und zweifach destilliertem Wasser
  • dieses Reaktionsgemisch wird nun auf das Endprodukt der vorausgegangenen PCR gebracht
  • gesamte Reaktion findet dann in einem Thermocycler statt
  • hier findet nun eine Einzelbasenverlängerung statt
  • am Ende der Reaktion sind folgende Dinge übrig: der um eine Base verlängerte SBE-Primer, verbliebene ddNTPs, das unveränderte PCR-Produkt und weitere Bestandteile des Gemisches.
  • lediglich der um eine Base verlängerte SBE-Primer ist von Bedeutung, alles Andere wird als störende Verunreinigung angesehen und durch eine Aufreinigung beseitigt

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