Fluoreszenzmikroskopie

Unter Fluoreszenz versteht man die Eigenschaft von Stoffen, kurzwelliges Licht (Anregungslicht) zu absorbieren und längerwelliges Licht (Emissionslicht) wieder abzugeben. Daher kann man mit dieser Methode nur Proben untersuchen, die von Natur aus fluoreszieren oder in die fluoreszierende Stoffe eingebracht wurden.

Das Licht aus einer Lichtquelle passiert einen Anregungsfilter, der die benötigte Anregungswellenlänge herausfiltert. Dieser Strahl trifft dann auf einen dichroitischen Spiegel, der eine kritische Wellenlänge besitzt. Hat der auftreffende Strahl eine kleinere Wellenlänge als die kritische Wellenlänge des Spiegels, so wird dieser reflektiert. Im umgekehrten Fall wird der Strahl durchgelassen. Die kritische Wellenlänge des Spiegels wird so gewählt, dass sie zwischen der Absorptions- und Emissionswellenlänge liegt. Dadurch wird das kürzerwellige Anregungslicht am Spiegel reflektiert und durch das Objektiv auf das Präparat gelenkt. Das Objektiv dient der Konzentrierung des Strahls.

Die Elektronen fluoreszierender Moleküle im Präparat absorbieren die Photonen und werden dadurch auf ein höheres Energieniveau gehoben, auf dem sie sich aber nicht halten können. Deshalb fallen die Elektronen auf ihr ursprüngliches Energieniveau zurück und setzen dabei die aufgenommene Energie wieder frei. Das energieärmere Emissionslicht hat eine größere Wellenlänge und ebenfalls eine andere Lichtfarbe als das energiereichere Anregungslicht. Die Differenz in der Wellenlänge zwischen den beiden Lichtarten wird als Stokes-Shift bezeichnet. Das längerwellige Emissionslicht wird im Objektiv konzentriert, auf den Spiegel gelenkt und kann diesen passieren, da die Wellenlänge des Emissionslichts über der kritischen Wellenlänge des Spiegels liegt. Ein Emissionsfilter sorgt dafür, dass nur das Emissionslicht auf den Detektor trifft, in dem das restliche Anregungslicht aus dem Strahl entfernt wird. Beim Detektor wird die Probe in der jeweiligen Emissionsfarbe vor schwarzem Hintergrund wahrgenommen.

In der Fluoreszenzmikroskopie unterscheidet man zwischen Primär-, Sekundär- und Immunfluoreszenz.