Multiphotonenmikroskopie
Englisch: multi-photon laser scanning microscope (MPLSM), multi-photon microscopy
Definition
Die Multiphotonenmikroskopie, kurz MPM, ist ein fluoreszenzmikroskopisches Verfahren, das eine hochauflösende dreidimensionale Untersuchung von Präparaten mit einer Eindringtiefe von bis zu einem Millimeter ermöglicht. Das Gerät selbst wird als Multiphotonenmikroskop bezeichnet. Es gehört zur Gruppe der Lichtmikroskope.
Hintergrund
Die Multiphotonenmikroskopie ermöglicht durch die erhöhte Eindringtiefe die Untersuchung von Geweben, die für andere Mikroskopietechniken nicht erreichbar sind. Sie bietet auch eine geringere Phototoxizität bei der Betrachtung lebender Zellen und ein geringeres Photobleaching.
Einteilung
Man unterscheidet zwei Verfahren der Multiphotonenmikroskopie.
Fluoreszenzmikroskopie
Die Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird nach der Anzahl der Photonen, die zur Anregung eines Fluorophors benötigt werden, in Zwei-Photonen-Mikroskope und Drei-Photonen-Mikroskope unterteilt. Die Signalstärke steigt quadratisch bzw. mit der dritten Potenz an und ist somit nicht linear. Wird ein Fluorophor durch ein Photon mit einer Wellenlänge von 350 nm angeregt, so benötigt man bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie zwei Photonen mit der doppelten und für die Drei-Photonen-Mikroskopie drei Photonen mit der dreifachen Wellenlänge. Da die Anregung durch mehrere Photonen innerhalb eines kurzen Zeitintervalls erfolgen muss, tritt die Absorption vor allem im Fokuspunkt auf. Dadurch wird das Photobleaching im umliegenden Gewebe minimiert und ein überlappendes Fluoreszenzsignal, das zu einem unscharfen Bild führt, vermieden. Aus diesem Grund wird bei einem Multiphotonenmikroskop im Gegensatz zu einem Konfokalmikroskop keine Lochblende benötigt.
Higher Harmonic Generation
Bei der Higher Harmonic Generation (HHG) wird eine Frequenzverdopplung (Second HHG) oder Frequenzverdreifachung (Third HHG) des eingestrahlten Lichts zur Entstehung von höheren Harmonischen genutzt. Dies ermöglicht die Bildgebung von nicht-behandelten Strukturen ohne Fluoreszenz oder exogene Marker. Außerdem bleibt keine Energie in den Strukturen zurück.