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Zinkfinger-Nuklease: Unterschied zwischen den Versionen

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*einer DNA-schneidenden Domäne ([[Nuklease]]).
  
 
Mittels der DNA-bindenden Domäne kann sich das [[Enzym]] als [[Dimer]] [[spezifisch]] an die ausgewählte DNA-Sequenz anlagern. Nach der Bindung schneidet die Nuklease den DNA-Strang ein, wodurch ein [[Doppelstrangbruch]] entsteht. Zelluläre [[DNA-Reparatur|Reparaturprozesse]] fügen die Stränge sofort wieder zusammen. Jedoch arbeiten diese meist ungenau, wodurch kleine [[Mutation]]en eingefügt werden. Unterbrechen diese Mutationen beispielsweise den [[Offener Leserahmen|offenen Leserahmen]], oder verändern eine essentielle Stelle im [[Gen]], dann wurde ein erfolgreicher [[Knockout]] erzeugt.
 
Mittels der DNA-bindenden Domäne kann sich das [[Enzym]] als [[Dimer]] [[spezifisch]] an die ausgewählte DNA-Sequenz anlagern. Nach der Bindung schneidet die Nuklease den DNA-Strang ein, wodurch ein [[Doppelstrangbruch]] entsteht. Zelluläre [[DNA-Reparatur|Reparaturprozesse]] fügen die Stränge sofort wieder zusammen. Jedoch arbeiten diese meist ungenau, wodurch kleine [[Mutation]]en eingefügt werden. Unterbrechen diese Mutationen beispielsweise den [[Offener Leserahmen|offenen Leserahmen]], oder verändern eine essentielle Stelle im [[Gen]], dann wurde ein erfolgreicher [[Knockout]] erzeugt.
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Obwohl Zinkfinger-Nukleasen zu den ältesten zielgerichteten Genom-Editing-Methoden zählt, gilt ihre Anwendung als sehr aufwendig. Besonders das sequenzspezifische Design der DNA ist mit Schwierigkeiten verbunden, da es unvorhergesehene Interaktionen der einzelnen Finger geben kann. Im Vergleich zum [[CRISPR/Cas-System]] und [[TALEN]]s ist dieser Schritt deutlich komplexer.
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Obwohl Zinkfinger-Nukleasen zu den ältesten zielgerichteten Genom-Editing-Methoden zählen, gilt ihre Anwendung als sehr aufwendig. Besonders das sequenzspezifische Design der DNA-bindenden Domäne ist mit Schwierigkeiten verbunden, da es unvorhergesehene Interaktionen der einzelnen Finger geben kann. Im Vergleich zum [[CRISPR/Cas-System]] und [[TALEN]]s ist dieser Schritt deutlich komplexer.
  
 
Da Zinkfinger-Nukleasen nur sehr geringe [[off-target-Mutation]]en aufweisen, ist ihre Anwendung im klinischen Bereich innerhalb einer potentiellen [[Gentherapie]] weiterhin relevant.
 
Da Zinkfinger-Nukleasen nur sehr geringe [[off-target-Mutation]]en aufweisen, ist ihre Anwendung im klinischen Bereich innerhalb einer potentiellen [[Gentherapie]] weiterhin relevant.

Aktuelle Version vom 30. Oktober 2018, 10:29 Uhr

Englisch: zink finger nucleases

1 Definition

Zinkfinger-Nukleasen, kurz ZFN, sind rekombinante Restriktionsenzyme, die im Genom-Editing verwendet werden. Sie können so anpasst werden, dass sie beliebige Sequenzen im Zielgenom verändern können.

2 Prinzip

Zinkfinger-Nukleasen bestehen aus zwei Domänen

  • einer DNA-bindenden Domäne (Zinkfinger) und einer
  • einer DNA-schneidenden Domäne (Nuklease).

Mittels der DNA-bindenden Domäne kann sich das Enzym als Dimer spezifisch an die ausgewählte DNA-Sequenz anlagern. Nach der Bindung schneidet die Nuklease den DNA-Strang ein, wodurch ein Doppelstrangbruch entsteht. Zelluläre Reparaturprozesse fügen die Stränge sofort wieder zusammen. Jedoch arbeiten diese meist ungenau, wodurch kleine Mutationen eingefügt werden. Unterbrechen diese Mutationen beispielsweise den offenen Leserahmen, oder verändern eine essentielle Stelle im Gen, dann wurde ein erfolgreicher Knockout erzeugt.

3 Design der Zinkfinger

Zinkfinger sind ein natürliches Strukturmotiv von vielen DNA-bindenden Proteinen, typischerweise Transkriptionsfaktoren. Für Zinkfinger-Nukleasen werden oftmals Cys2-His2-Zinkfinger verwendet. Diese bestehen aus ca. 30 Aminosäuren, wobei sechs direkten Kontakt mit der DNA besitzen. Ein Zinkfinger kann drei Basen binden. Dies wäre für eine spezifische Anwendung im Genom zu kurz, weswegen mehrere Zinkfinger miteinander verbunden werden. Dies geschieht durch Kombination verschiedener Module. Das fertige Konstrukt bindet meist eine Region von 15-20 bp. Erst als Dimer wird das Enzym aktiv, wodurch die Spezifität deutlich erhöht wird.

4 Unterschied zu anderen Genom-Editing Methoden

Obwohl Zinkfinger-Nukleasen zu den ältesten zielgerichteten Genom-Editing-Methoden zählen, gilt ihre Anwendung als sehr aufwendig. Besonders das sequenzspezifische Design der DNA-bindenden Domäne ist mit Schwierigkeiten verbunden, da es unvorhergesehene Interaktionen der einzelnen Finger geben kann. Im Vergleich zum CRISPR/Cas-System und TALENs ist dieser Schritt deutlich komplexer.

Da Zinkfinger-Nukleasen nur sehr geringe off-target-Mutationen aufweisen, ist ihre Anwendung im klinischen Bereich innerhalb einer potentiellen Gentherapie weiterhin relevant.

5 Quellen

Fachgebiete: Genetik, Gentechnik

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