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Polymerase-Kettenreaktion: Unterschied zwischen den Versionen

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Die '''PCR''' ist ein [[enzym]]abhängiges Verfahren zur Vervielfältigung bestimmter [[Gen]]-Sequenzen innerhalb einer vorliegenden [[DNA]]-Kette. Sie kommt unter physiologischen Bedingungen bei der [[Replikation]] in allen Zellen vor und kann auch gentechnisch für die [[In vitro]]-Amplifizierung von Gensequenzen verwendet werden.
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Die '''Polymerase-Kettenreaktion''' bzw. '''PCR''' ist ein [[enzym]]abhängiges Verfahren zur Vervielfältigung bestimmter [[Gen]]-Sequenzen innerhalb einer vorliegenden [[DNA]]-Kette. Sie kommt unter physiologischen Bedingungen bei der [[Replikation]] in allen Zellen vor und kann auch gentechnisch für die [[In vitro]]-Amplifizierung von Gensequenzen verwendet werden.
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In der [[Medizinische Umgangssprache|medizinischen Umgangssprache]] wird PCR häufig als Synonym für jede auf [[Nukleinsäure]]-Untersuchungen beruhende Diagnostik benutzt, auch wenn es sich technisch nicht um eine Polymerase-Kettenreaktion handelt.
  
 
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Das Verfahren der PCR benötigt eine doppelsträngige DNA-Kette mit zumindest teilweise bekannter Sequenz. Zur Durchführung der [[Amplifikation]] sind außerdem zwei [[Primer]]-RNAs essentiell, die auf beiden Seiten der Sequenz jeweils an eine der Ketten binden können sowie einzelne [[Nukleosidtriphosphat]]-Moleküle und eine hitzestabile [[Polymerase]], die üblicherweise aus Thermus aquaticus ([[Taq-Polymerase]]) isoliert wird.  
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Das Verfahren der PCR benötigt eine einzel- oder doppelsträngige DNA-Kette mit zumindest teilweise bekannter Sequenz. Zur Durchführung der [[Amplifikation]] sind außerdem zwei [[Primer]]-DNAs essentiell, die auf beiden Seiten der Sequenz jeweils an eine der Ketten binden können sowie einzelne [[Nukleosidtriphosphat]]-Moleküle und eine hitzestabile [[Polymerase]], die üblicherweise aus Thermus aquaticus ([[Taq-Polymerase]]) isoliert wird.  
  
 
Die PCR wird heute üblicherweise apparativ in einem [[Thermocycler]] durchgeführt. Sie läuft in mehreren Schritten ab:
 
Die PCR wird heute üblicherweise apparativ in einem [[Thermocycler]] durchgeführt. Sie läuft in mehreren Schritten ab:
  
 
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===Denaturierung===
Durch Erwärmung des Versuchs-[[Assay]]s auf bis zu 96°[[Celsius|C]] wird die [[DNA]] [[Denaturierung|denaturiert]], indem die [[Wasserstoffbrücke]]n zwischen den beiden Ketten der zu vervielfältigenden [[DNA]] gespalten werden. Die Nukleinsäure liegt danach einzelsträngig vor.
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Durch Erwärmung des Versuchs-[[Assay]]s auf bis zu 96°[[Celsius|C]] wird die [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]] [[Denaturierung|denaturiert]], indem die [[Wasserstoffbrücke]]n zwischen den beiden Ketten der zu vervielfältigenden DNA gespalten werden. Die Nukleinsäure liegt danach einzelsträngig vor.
  
 
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===Primer-Bindung===
Nach Abkühlung des Versuchsansatzes auf etwa 70°C binden die [[Primer]] jeweils an das 3'-Ende der Gensequenz.
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Beim [[Annealing]] bzw. der Primerhybridisierung wird der Versuchsansatz auf ungefähr 55 bis 65°C abgekühlt und die [[Primer]] binden jeweils an das 3'-Ende der Gensequenz. Die konkrete Temperatur hängt dabei von der Nukleinsäuresequenz und -länge der verwendeten Primer ab.
  
 
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===Polymerase-Bindung und DNA-Synthese===  
Die [[Polymerase]] synthetisiert vom Primer aus in 5'-3'-Richtung den komplementären Strang. Beim ersten Durchgang entstehen Ketten variabler Länge, da die Polymerase nach der Replikation einer zufälligen Anzahl von Basenpaaren die Synthese abbricht.
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Während der [[Elongation]] synthetisiert die [[Polymerase]] bei einer Temperatur von ca. 72°C vom Primer aus in 5'-3'-Richtung den komplementären Strang. Beim ersten Durchgang entstehen Ketten variabler Länge, da die Polymerase nach der Replikation einer zufälligen Anzahl von Basenpaaren die Synthese abbricht.
  
 
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Die Anwendungen der PCR sind vielfältig: Sie wird [[gerichtsmedizin]]isch bei der Vaterschaftsdiagnostik oder bei der Analyse von am Tatort gewonnenen genetischen Materials ([[Genetischer Fingerabdruck]]) ebenso verwendet wie bei der [[genetisch]]en Diagnose von [[Erbkrankheit]]en aus Blutproben oder [[Chorionzottenbiopsie]]-Material.
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Die Anwendungen der PCR sind vielfältig: Sie wird [[gerichtsmedizin]]isch bei [[Abstammungsgutachten]] oder bei der Analyse von am Tatort gewonnenem [[genetisch]]em Material ([[Genetischer Fingerabdruck]]) ebenso verwendet wie bei der Diagnose von [[Erbkrankheit]]en aus [[Blutprobe]]n oder [[Chorionzottenbiopsie]]-Material.
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Die für die gentechnische Herstellung von [[Protein]]en benötigte DNA wird heute durch PCR hergestellt.  
  
Daneben lassen sich [[Bakterium|Bakterien]] oder [[Pilz]]e je nach ihrem genetischen Material mit Hilfe von PCR-Reaktionen charakterisieren. Stämme von [[Virus|Viren]] lassen sich mit einem abgewandeltem Verfahren, der [[RT-PCR]] nachweisen.
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Daneben lassen sich [[Bakterium|Bakterien]] oder [[Pilz]]e je nach ihrem genetischen Material mit Hilfe von PCR-Reaktionen charakterisieren. Stämme von [[RNA-Virus|RNA-Viren]] lassen sich mit einem abgewandeltem Verfahren, der [[Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion]] nachweisen.
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* [[Randomly Amplified Polymorphic DNA]] (RAPD)
  
 
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Aktuelle Version vom 19. Februar 2020, 19:31 Uhr

Abkürzung für: Polymerase Chain Reaction
Synonym: Polymerase-Kettenreaktion

1 Definition

Die Polymerase-Kettenreaktion bzw. PCR ist ein enzymabhängiges Verfahren zur Vervielfältigung bestimmter Gen-Sequenzen innerhalb einer vorliegenden DNA-Kette. Sie kommt unter physiologischen Bedingungen bei der Replikation in allen Zellen vor und kann auch gentechnisch für die In vitro-Amplifizierung von Gensequenzen verwendet werden.

In der medizinischen Umgangssprache wird PCR häufig als Synonym für jede auf Nukleinsäure-Untersuchungen beruhende Diagnostik benutzt, auch wenn es sich technisch nicht um eine Polymerase-Kettenreaktion handelt.

2 Verfahren

Das Verfahren der PCR benötigt eine einzel- oder doppelsträngige DNA-Kette mit zumindest teilweise bekannter Sequenz. Zur Durchführung der Amplifikation sind außerdem zwei Primer-DNAs essentiell, die auf beiden Seiten der Sequenz jeweils an eine der Ketten binden können sowie einzelne Nukleosidtriphosphat-Moleküle und eine hitzestabile Polymerase, die üblicherweise aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) isoliert wird.

Die PCR wird heute üblicherweise apparativ in einem Thermocycler durchgeführt. Sie läuft in mehreren Schritten ab:

2.1 Denaturierung

Durch Erwärmung des Versuchs-Assays auf bis zu 96°C wird die DNA denaturiert, indem die Wasserstoffbrücken zwischen den beiden Ketten der zu vervielfältigenden DNA gespalten werden. Die Nukleinsäure liegt danach einzelsträngig vor.

2.2 Primer-Bindung

Beim Annealing bzw. der Primerhybridisierung wird der Versuchsansatz auf ungefähr 55 bis 65°C abgekühlt und die Primer binden jeweils an das 3'-Ende der Gensequenz. Die konkrete Temperatur hängt dabei von der Nukleinsäuresequenz und -länge der verwendeten Primer ab.

2.3 Polymerase-Bindung und DNA-Synthese

Während der Elongation synthetisiert die Polymerase bei einer Temperatur von ca. 72°C vom Primer aus in 5'-3'-Richtung den komplementären Strang. Beim ersten Durchgang entstehen Ketten variabler Länge, da die Polymerase nach der Replikation einer zufälligen Anzahl von Basenpaaren die Synthese abbricht.

2.4 Erneute Denaturierung

Die neu synthetisierten Ketten werden wieder bei 96°C geschmolzen und ermöglichen eine wiederholte Anlagerung von Primern.

2.5 Erneute DNA-Synthese

An alle einzelsträngigen DNA-Moleküle kann die Polymerase erneut ansetzen und Doppelstränge synthetisieren. Dabei entstehen nur an der ursprünglichen DNA wieder Fragmente zufälliger Länge, während bei den synthetisierten Nukleinsäuren die Polymerisation des Gegenstranges am Beginn des ursprünglichen Primers endet.

2.6 Repetition des Vorgangs

Der Ablauf von Schmelzen, Primer-Bindung und Synthese kann so lange wiederholt werden, bis die benötigte DNA-Menge hergestellt ist. Dabei entstehen in exponentieller Menge DNA-Fragmente einer bestimmten Länge, die für weitere gentechnische Experimente verwendet werden können.

3 Anwendungen

Die Anwendungen der PCR sind vielfältig: Sie wird gerichtsmedizinisch bei Abstammungsgutachten oder bei der Analyse von am Tatort gewonnenem genetischem Material (Genetischer Fingerabdruck) ebenso verwendet wie bei der Diagnose von Erbkrankheiten aus Blutproben oder Chorionzottenbiopsie-Material.

In modifizierter Form, zum Beispiel als Realtime-PCR, kann die Menge des genetischen Materials in der Probe quantifiziert werden.

Die für die gentechnische Herstellung von Proteinen benötigte DNA wird heute durch PCR hergestellt.

Daneben lassen sich Bakterien oder Pilze je nach ihrem genetischen Material mit Hilfe von PCR-Reaktionen charakterisieren. Stämme von RNA-Viren lassen sich mit einem abgewandeltem Verfahren, der Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion nachweisen.

4 Varianten

5 Links

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Fachgebiete: Diagnostik, Labormedizin

Diese Seite wurde zuletzt am 19. Februar 2020 um 19:31 Uhr bearbeitet.

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