Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Abkürzung: FISH

Englisch: fluorescence in situ hybridization

1 Definition

Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung handelt es sich um ein Verfahren der Zytogenetik, das dem Nachweis von Chromosomenaberrationen dient, welche dem Nachweis durch ein konventionelles Karyogramm entgehen.

2 Prinzip

Man verwendet Fluoreszenz-markierte DNA-Sonden, die spezifisch an bestimmte DNA-Stellen auf den Chromosomen binden können. Diese Verbindung bezeichnet man als Hybridisierung. Bindet eine solche gefärbte Sonde an die DNA , können mittels Mikroskop die Lokalisation und die Anzahl der Kopien ausgewertet werden.

Durch die FISH-Technik kann eine Vielzahl von Ziel-DNAs durch unterschiedlich markierte DNA-Sonden in Kombination mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gleichzeitig mit Hilfe einer besonderen Auswertungssoftware analysiert werden, was als Multicolor-FISH (M-Fish) bezeichnet wird. Das ermöglicht auch die simultane, differenzielle Darstellung von allen 22 Autosomen und den 2 Gonosomen (24-Farben-FISH) oder auch die Darstellung von Banden eines Chromosomes (Multicolor Banding, MCB).

3 Einteilung

Es sind folgende FISH-Methoden möglich:

• Direkter Nachweis: Ein Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Dinitrophenol) ist direkt an eine DNA-Sonde gebunden, so dass die mikroskopische Analyse der Ziel-DNA sofort nach der Hybridisierung erfolgen kann.
• Indirekter Nachweis: Die DNA-Sonde ist nicht direkt mit Fluoreszenzfarbstoff markiert, sondern mit einem Stoff wie Biotin oder Digoxigenin, an den erst nach Hybridisierung mit der Ziel-DNA fluoreszierende Stoffe (Avidin oder spezielle Antikörper) binden können. Diese indirekte Methode ist komplizierter, aber sensitiver.

4 verschiedene DNA-Sonden

Je nach Fragestellung können verschiedene DNA-Sonden eingesetzt werden. Man unterscheidet primär folgende Typen:

• Chromosomenspezifische Zentromer-DNA-Sonden: Zum Nachweis numerischer Chromosomenveränderungen (mehrere 1000 kbp, beim Interphase-Kern)
• Lokusspezifische DNA-Sonden: Sie markieren chromosomenspezifische Zielsequenzen (5-200 kbp), sprich bestimmte Gene, Chromosomensegmente oder Chromosomenarme und eignen sich zum Nachweis von kleinen Mutationen (Deletionen, Duplikationen, Translokationen) im Metaphase-Kern, aber auch zum Nachweis von numerischen Aberrationen im Interphase-Kern.
• Chromosomenspezifische DNA-Library-Sonden: Erfassung von Translokationen und Insertionen durch spezifische Markierung eines einzelnen Chromosoms ("whole chromosome painting", WCP) mittels vielen kleinen Einzelsonden.
• Vergleichende Genomhybridisierung (comparative genomic hybridization, CGH): Umfassende Analyse von Zugewinn/Verlust an chromosomalem Material, in dem DNA aus Gewebe und Kontroll-DNA um Hybridisierungsstellen in einem Metaphasenchromosom konkurrieren und die Menge an DNA-Material anhand der Stärke des Fluoreszenzsignals geprüft wird.

5 Beispiel

Pränataldiagnostik bei Verdacht auf ein Down-Syndrom: hier verwendet man DNA-Sonden, die an Chromosom 21 binden können und es sichtbar machen (wenn es 3-fach - nicht wie normal 2-fach - vorliegt, handelt es sich um das Down-Syndrom).

6 Weblinks

Identifizierung von Proteobakterien mittels FISH