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Western Blot

Synonym: Immunblot
Englisch: immunoblot

1 Definition

Der Western Blot ist ein molekularbiologisches Verfahren zum Nachweis von Proteinen durch Übertragung (Blotting) auf eine Trägermembran. Durch verschiedene anschließende Reaktionen können dann bestimmte Proteine nachgewiesen werden.

2 Herkunft des Namens

1975 wurde das erste Blotverfahren zum Nachweis von DNA-Fragmenten von Edwin Southern und dem Namen Southern Blot eingeführt. Daran angelehnt wurden der Nachweis von RNA als Northern Blot und der Nachweis von Proteinen als Western Blot bezeichnnet.

3 Methode

Vor dem eigentlichen Western Blot muss das Proteingemisch aufgetrennt werden. Ein Beispiel wäre hier die SDS-Page, bei dem die Proteine im elektrischen Feld entsprechend ihrer Größe unterschiedlich weit auf einem Polyacrylamid-Gel wandern. Nachdem die Proteine nun 'sortiert' sind werden sie mit Hilfe eines weiteren elektrischen Feldes, welches senkrecht zu dem Gel steht, auf eine PVDF- oder Nitrocellulose-Membran übertragen.


Aufbau-wb.png

Schematischer Aufbau eines Western Blot: Schlitten (a), Schwämme (b), dünne- (c) u. dicke- (d) Wattman-Papiere, PVDF-Membran (e), Polyacrylamid Gel (f)


Die Proteinbanden sind nun fest auf der Membran gebunden und können nun mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden. Am häufigsten werden hier Antikörper verwendet, die an ein bestimmtes Protein binden. Damit ein Ergebnis zustande kommt, müssen vorher die freien Bindungsstellen auf der Membran mit Proteinen, die nicht von Antikörpern erkannt werden können, blockiert werden. Dazu behandelt man die Membran z.B. mit Bovinem Serumalbumin oder einer Milchpulver-Lösung.

Anschließend werden zwei verschiedene Antikörper auf die Membran gegeben. Die Primärantikörper binden zunächst an das gesuchte Protein. Nach dem Entfernen unspezifisch bindender Antikörper durch Waschen wird die Membran mit einem Sekundärantikörper behandelt. Der Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper und ist z.B. an ein Enzym gekoppelt, welches eine Farbreaktion katalysiert.

Nach dem Auftragen der Antikörper wird die Membran mehrfach gewaschen, um alle überschüssigen Antikörper zu entfernen. Die katalysierte Farbreaktion kann nun durch Zugabe eines entsprechenden Substrats gestartet werden. In den Banden, in denen das gesuchte Protein sitzt, kann die gewünschte Farbreaktion beobachtet werden.

Alternativ kann der Sekundärantikörper auch Radioaktiv markiert sein, was einen Nachweis auf Photopapier erlaubt.

Eine weitere Möglichkeit ist, Meerrettich-Peroxidase gekoppelte Sekundärantikörper zu verwenden, die einen Nachweis des Proteins durch Chemolumineszenz erlauben.

4 Anwendung

In der Medizin wird der Western Blot vor allem zur Diagnose von Infektionen verwendet. Hierbei werden die spezifischen Antikörper im Serum nachgewiesen. Auch andere krankheitsrelevante Proteine, wie das HI-Virus, können nachgewiesen werden.

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