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Affinitätschromatografie

Englisch: affinity chromatography

1 Definition

Als Affinitätschromatographie bezeichnet man eine chromatographische Reinigungsmethode, die auf reversiblem Binden von biologischen Makromolekülen an eine für sie spezifische Matrix beruht.

2 Prinzip

Die Affinititätschromatographie kann zur Isolierung eines einzelnen Moleküls aus einer Lösung verwendet werden, wenn dieses spezifisch an einen Liganden binden kann. Die Matrix besteht in der Regel aus Agarose-Derivaten, die selbst sehr reaktionsarm sind. Durch die kovalente Bindung eines Liganden an diese Matrix wird die Spezifität erreicht. Dabei kann zusätzlich ein sogenannter Spacer eingefügt werden, der den Abstand zwischen Ligand und Matrix erhöht. Dadurch kann die Interaktion zwischen Ligand und Molekül verbessert werden.

Bei der Wahl des Liganden ist auf die Bindungskonstante KD zu achten, die im Bereich zwischen 10-5 M und 10-7 M liegen sollte. Die Bindungskonstante KD gibt dabei Aufschluss über die Affinität und Bindungsstärke zwischen Ligand und Molekül.

Bei KD:

  • > 10-4M: Die Bindung des Moleküls an den Liganden ist zu schwach; eine effektive Reinigung ist nicht möglich.
  • > 10-8M: Die Bindung des Moleküls an den Ligand ist zu stark, so dass eine Elution nicht mehr möglich ist.

Als Alternative zur Matrix mit spezifischen Liganden können auch sog. Affinitätsgele verwendet werden.

3 Durchführung

3.1 Allgemein

Zunächst werden die Matrix und die Lösung, in dem sich das zu isolierende Molekül befindet, in einem geeigneten Puffer äqiulibriert und nach Einstellung des pH-Werts und der Ionenstärke auf eine Säule aufgetragen. Die zu isolierenden Moleküle binden nun an die Liganden an der Matrix und alle restlichen Moleküle können durch mehrmaliges Waschen mit spezieller Waschlösung entfernt werden. Zu Lösung der gebundenen Moleküle wird eine sogenannte Elution durchgeführt. Schließlich wird die Matrix wieder regeneriert.

3.2 Elution

Die Elution bei der Affinitätschromatographie beruht grundsätzlich darauf, dass die Interaktion zwischen Ligand und Molekül geschwächt wird. Dies kann erreicht werden durch:

4 Nachteile

  • Schwierige Elution, da Affinität zwischen Ligand und zu isolierendem Molekül extrem hoch ist
  • Oftmals nur geringe Verfügbarkeit der Affinitätsgele

5 Anwendungsbereiche

Spezifische Bindung und Erkennung von:

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